检索结果-南通市图书馆

作者：付强齐鲁工业大学

学位级别：硕士

液体环境中食源性生物污染物的简单、快速、超灵敏检测对污染物的控制尤为重要。目前,应用在食源性致病菌上的检测方法主要包括传统的生物培养法、抗原抗体法和核酸检测法。这些方法虽然具有一定的精准度和特异性,但是它们费时费力并且... 详细信息

液体环境中食源性生物污染物的简单、快速、超灵敏检测对污染物的控制尤为重要。目前,应用在食源性致病菌上的检测方法主要包括传统的生物培养法、抗原抗体法和核酸检测法。这些方法虽然具有一定的精准度和特异性,但是它们费时费力并且需要专业的操作人员,这严重阻碍了他们在即时检测(point-of-care testing,POCT)中的应用。因此,开发一种高效迅速,简单便携的检测方法显得尤为重要。本课题开发了一个可以快速检测液体环境中食源性致病菌的生物传感器,并且在此基础上进行了深度优化。该传感器基于侧向流动技术结合重组酶聚合酶等温扩增法,可以应用于食源性生物污染物的现场即时检测。本课题主要分为三个体系,主要研究工作如下:(1)肠炎沙门氏菌是一种广泛存在和具有高度传染性的生物污染物,可引起人畜共患疾病。血清型肠炎沙门氏菌的大多数检测方法都是定性的,而定量方法费时、费力,并依赖于大型分析仪器。因此,开发一种快速、简单、定量的检测方法对于在疾病爆发早期阶段的预防和控制感染非常重要。为了满足这一要求,我们开发了一种基于链酶亲和素包裹金纳米粒子(Strept Av-Au NPs)的侧流(LF)试纸条生物传感器,结合重组酶聚合酶等温扩增(RPA),用于快速定量检测血清型肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)。Strept Av-Au NPs的合成很简单,并与末端修饰有生物素的DNA牢固结合。此外,RPA可以大大减少检测时间。智能手机被用来收集LF试纸条的图像,并将其输入笔记本电脑进行定量分析。整个过程在不到40 min内完成,不需要大型实验室设备或分析仪器。对于合成的S.Enteritidis的DNA序列和培养的纯菌样品,视觉检测限(LOD)分别为1×10-11 M和2.5×103 CFU/m L,定量LOD分别为5.5×10-13 M和91.4 CFU/m L。在重现性测定中,对三种不同浓度的样品,相对标准偏差分别为5.88%、5.13%和4.45%。该生物传感器具有成本低、精度高、定量快等优点,并且被成功应用在了饮用水的实际样品检测中。(2)肠出血性大肠杆菌(EHEC O157:H7)是引起人类腹泻最常见的生物污染物之一,尤其是儿童。EHEC O157:H7可以通过被污染的水或食物,或通过与动物或人的接触传播。目前,免疫学领域用于检测EHEC O157:H7的主要方法是抗原抗体检测和基于聚合酶链反应的核酸检测,这些方法需要昂贵的成本和实验室仪器,不适合医疗卫生条件差的发展中国家在大规模筛选致病菌时使用。为了解决这个问题,本研究开发了一种基于自加热重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的一体化侧流试纸条生物传感器。该生物传感器由试纸条装置、连接器、RPA反应室、支撑装置和加热装置组成,其生产成本远低于抗原-抗体法。整个检测过程在不到25 min内完成,且不需要依赖任何大型实验室设备或分析仪器。对培养的EHEC O157:H7纯菌样品和饮用水中的EHEC O157:H7分别达到了1×103 CFU/m L,3.5×103CFU/ml的视觉检测限(LOD)和104.02 CFU/m L,366.70 CFU/m L的定量LOD。在重现性测定中,对三种不同浓度的样品,相对标准偏差分别为5.39%、3.85%和4.82%。该方法不仅可以快速定量检测样品中的EHEC O157:H7,而且生产成本低,操作简单,便于携带,在医疗设施落后的发展中国家具有良好的发展潜力。(3)免疫学方法是检测环境中生物污染物的有效手段,如抗原抗体法,酶联免疫吸附试验。它们虽然具有很高的特异性和灵敏度,但是它们的检测限(LOD)相对较大。聚合酶链式反应(PCR)及其衍生方法(RT-PCR和多重PCR)的LOD表现良好,但是它们需要专业的操作人员和昂贵的实验设备。为了解决这一问题,本研究开发了一个便携式双重信号放大的侧流试纸条生物传感器用于超灵敏检测液体环境中的生物类污染物。第一种放大是重组酶聚合酶等温扩增(RPA)反应,可以在短时间内对目标物达到指数式放大;第二重放大为链酶亲和素-生物素系统。该方法对肠炎沙门氏菌分别达到了2.5×102 CFU/m L和33.99 CFU/m L的视觉LOD和定量LOD。该方法的LOD要远低于抗原抗体法,同时比前两个体系所报道的侧流试纸条的视觉LOD提高了一个数量级。本研究所开发的侧流试纸条生物传感器成功应用在了饮用水中肠炎沙门氏菌和大肠杆菌实际样品的检测,并对该生物传感器的便携性和检测限进行了不断的优化,使其更好的应用在生物污染物的现场检测。同时,该生物传感器不仅仅只局限在检测食源性生物污染物,也适用于各种含有DNA的污染物的检测。

关键词：食源性致病菌生物传感器重组酶聚合酶等温扩增侧流试纸条即时检测

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基于CRISPR/Cas系统建立牛、羊支原体性肺炎主要亚种的快速检测方法

基于CRISPR/Cas系统建立牛、羊支原体性肺炎主要亚种的快速检测方...

引用

作者：曹婕内蒙古大学

学位级别：硕士

世界动物卫生组织(OIE)列出的两种由支原体引起的反刍动物严重型呼吸道疾病,一种是牛支原体性肺炎(BMP)又叫传染性牛胸膜肺炎(CBPP),另一种羊支原体性肺炎(MPSG)也叫羊传染性胸膜肺炎(CCPP)。随着牛、羊及其相关产品的流通调运日趋增多... 详细信息

世界动物卫生组织(OIE)列出的两种由支原体引起的反刍动物严重型呼吸道疾病,一种是牛支原体性肺炎(BMP)又叫传染性牛胸膜肺炎(CBPP),另一种羊支原体性肺炎(MPSG)也叫羊传染性胸膜肺炎(CCPP)。随着牛、羊及其相关产品的流通调运日趋增多,该疫病在全球范围内长期分布和流行,且不同地区流行不同亚种;同时由于不同亚种支原体在牛、羊呼吸道疾病中协同作用,且临床症状表现极为相似,难以进行现场鉴别;鉴于不同亚种支原体疫苗间交叉保护性有限等原因,需研发具有鉴别不同亚型支原体且适合于现地的快速检测试剂盒。本研究针对牛支原体性肺炎主要亚种:牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae,M.aga)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium,M.bovige);羊支原体性肺炎主要亚种:绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)、丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri,Mmc)、山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capricolum,Mcc)的保守基因进行分析,针对保守基因建立了一种新型快速核酸检测方法,将牛种、羊种进行种间区分,且对不同亚种进行有效鉴别。本论文将重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)与Cas13a蛋白进行结合,特异性的识别并匹配目标序列,通过Cas效应器切割活性释放信号,将检测结果以荧光或侧向流层析试纸条(胶体金法)呈现。检测灵敏度可达10 copies/μl,整个检测过程无需热循环仪并且操作设备简易,用时短,检测灵敏度与特异性较PCR、染料法q PCR提高一个数量级。同时在优化检测过程中实现了在单管反应体系内对两个不同亚种核酸目的片段的双重RPA扩增并进行有效检测,检测结果最快可在5min裸眼下观察到,15min荧光检测亮度能达到最高,检测效果灵敏、时间短,在降低实验成本的同时仍然能够将检测结果快速高效、特异性、可视化准确呈现。综上,利用CRISPR/Cas13a对牛、羊支原体性肺炎主要亚种建立的快速检测方法实现了高效、灵敏、特异的核酸检测,为牛、羊支原体性肺炎的即时检测(POCT)提供了创新性的思路和方法,真正意义上实现“便携式”的快速核酸检测。

关键词：牛、羊支原体性肺炎亚种重组酶聚合酶等温扩增 CRISPR/Cas 核酸快速检测

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

重组酶等温扩增试纸条检测阪崎克罗诺杆菌的研究

重组酶等温扩增试纸条检测阪崎克罗诺杆菌的研究

引用

作者：陈纯阳天津科技大学

学位级别：硕士

阪崎克罗诺杆菌是一种食源性条件致病菌,它会导致不同年龄人群,特别是新生儿和免疫功能不健全的婴幼儿的疾病。这一致病菌的国家标准检测方法为传统培养方法,这一方法通常需要7 d时间,费时费力。基于聚合酶链式反应的分子检测方法虽然... 详细信息

阪崎克罗诺杆菌是一种食源性条件致病菌,它会导致不同年龄人群,特别是新生儿和免疫功能不健全的婴幼儿的疾病。这一致病菌的国家标准检测方法为传统培养方法,这一方法通常需要7 d时间,费时费力。基于聚合酶链式反应的分子检测方法虽然较传统培养方法极大地缩短了检测时间,且灵敏度高,但是需要昂贵精准的仪器设备进行检测,对操作人员的专业要求较高,因此不便于在条件有限的地区应用。在本研究中,我们将重组酶聚合酶等温扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）与免疫层析试纸条（lateral flow strip,LF）相结合,建立了一种阪崎克罗诺杆菌快速检测方法。本研究对RPA-LF检测阪崎克罗诺杆菌的条件进行了优化,结果显示,RPA扩增的最佳条件为45℃的扩增15 min。灵敏度检测结果显示该方法对于纯培养的目标菌的检测限为1.7×102 CFU/mL,特异性分析结果显示,RPA-LF方法与其他常见病原菌没有交叉反应。用食物样品评估RPA-LF检测效果,结果显示增菌4h或6h后,检测限达到1.7×100 CFU/g。此方法对阪崎克罗诺杆菌的检测操作简单,可快速直观进行结果观察,而且有很高的特异性和灵敏度。该方法适用于资源环境有限的地区和食品企业进行阪崎克罗诺杆菌的快速检测。RPA被称为最接近“等温扩增”的方法,它可以在较低的温度下,在20 min内完成检测。本研究利用大肠杆菌重组表达系统,对RPA扩增所需的三种主要蛋白的基因进行重组表达,包括Bsu DNA聚合酶、T4 UvsX重组酶和T4 gp32结合蛋白。其中Bsu DNA聚合酶分子量约为64 kDa,最佳诱导条件为IPTG 0.05 mmol/L,在30℃诱导8 h,纯化后蛋白浓度可以达到0.26 mg/mL;T4 UvsX重组酶分子量约为43 kDa,最佳诱导条件为IPTG 0.005 mmol/L,在20℃诱导12 h,纯化后蛋白浓度可以达到0.27 mg/mL;T4 gp32结合蛋白分子量约为33 kDa,最佳诱导条件为IPTG 0.05 mmol/L,在30℃诱导8h,纯化后蛋白的浓度可以达到0.20 mg/mL,活性分析结果显示,重组表达的蛋白对于目标基因具有扩增活性。本研究的开展,对于阪崎克罗诺杆菌快速检测技术的发展以及RPA等温扩增技术在微生物快速检测中的推广应用奠定了良好的基础。

关键词：阪崎克罗诺杆菌重组酶聚合酶等温扩增试纸条重组表达

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基于双重CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒核酸胶体金检测试纸条的研制

引用

检验医学与临床 2023年第21期20卷 3126-3131页

作者：黄涛魏道舜钱纯亘李永聪刘仲明李辉军汪大明张赛深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司广东深圳518116 华中科技大学生命科学与技术学院湖北武汉430074 中国人民解放军南部战区总医院医学实验科广东广州510010 华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科湖北武汉430030 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏苏州215163

目的为实现快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2),干预和防止病毒的传播,研制一种基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条。方法通过设计基于ORF1ab和N基因靶序列内的正反两个依赖原间隔邻近基序(PAM)位点crRNAs,将恒... 详细信息

目的为实现快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2),干预和防止病毒的传播,研制一种基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条。方法通过设计基于ORF1ab和N基因靶序列内的正反两个依赖原间隔邻近基序(PAM)位点crRNAs,将恒温扩增技术与CRISPR-Cas12a检测相结合,并结合侧向层析试纸条技术,实现对SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因同时扩增与双重CRISPR的可视化检测。结果检测试纸条可在37℃条件下20 min内取得结果,具有较好的灵敏度、特异度及热稳定性。对SARS-CoV-2假病毒的检测灵敏度为250 copy/mL,检测16种其他呼吸道病原体均无交叉反应,在37℃条件下存放8 d仍然具有较好检测效果。临床研究显示,检测SARS-CoV-2总符合率为95.00%(57/60)。结论基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于SARS-CoV-2的现场快速检测。

关键词：新型冠状病毒重组酶聚合酶等温扩增成簇规律间隔短回文重复序列相关核酸内切酶12a 胶体金免疫层析快速检测

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

猪霍乱沙门氏菌RPA-LFS快速检测方法的建立

引用

吉林农业大学学报 2021年

作者：周红蕾钱俞佳刘静江苏农牧科技职业学院宠物科技学院江苏华创信诺医药科技有限公司

本研究旨在建立一种快速、准确的猪霍乱沙门氏菌现场检测方法. 针对猪霍乱沙门氏菌侵袭蛋白A(invasion protein A， invA)基因序列设计特异性引物和探针，优化反应条件，建立了重组酶聚合酶等温扩增结合侧向流层析试纸条(RPA-LFS)检测... 详细信息

本研究旨在建立一种快速、准确的猪霍乱沙门氏菌现场检测方法. 针对猪霍乱沙门氏菌侵袭蛋白A(invasion protein A， invA)基因序列设计特异性引物和探针，优化反应条件，建立了重组酶聚合酶等温扩增结合侧向流层析试纸条(RPA-LFS)检测方法. 结果表明，建立的方法在39℃等温条件下15 min内即可特异性检出猪霍乱沙门氏菌，与金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌无交叉反应，该方法对猪霍乱沙门氏菌的最低检出限为1 cfu/反应. 应用该方法对50份猪肉样本进行检测，与PCR方法检测结果一致. 结果提示，本研究建立的猪霍乱沙门氏菌现场RPA-LFS检测方法敏感性高、特异性强、反应快速、操作简便的特点，可应用于猪霍乱沙门氏菌的临床快速检测.

关键词：猪霍乱沙门氏菌侵袭蛋白A 重组酶聚合酶等温扩增侧向流层析试纸条

来源：

同方期刊数据库评论

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

一种基于RPA的番茄褪绿病毒检测方法

引用

植物保护 2020年第4期46卷 168-170,184页

作者：宋建薛俊孙海波王姝金凤媚天津市农业生物技术研究中心天津300192

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起番茄褪绿病毒病,给番茄生产造成严重危害。开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。利用番茄褪绿病毒外壳蛋白(CP)基因序列,设计特异性引物,建立了ToCV的重组酶聚合酶等温扩增... 详细信息

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起番茄褪绿病毒病,给番茄生产造成严重危害。开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。利用番茄褪绿病毒外壳蛋白(CP)基因序列,设计特异性引物,建立了ToCV的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,同时分析了该方法的灵敏度和特异性。结果表明,建立的ToCV-RPA方法在38℃恒温下40 min可从ToCV阳性的番茄样品中扩增出246 bp的特异性条带。扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR方法的10倍,适用于ToCV的快速检测。

关键词：番茄番茄褪绿病毒重组酶聚合酶等温扩增

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

基于RNAi技术的转基因植物检测方法的构建及信号放大策略的研究

基于RNAi技术的转基因植物检测方法的构建及信号放大策略的研究

引用

作者：郑宇上海师范大学

学位级别：硕士

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由内源或外源的双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)引发m RNA降解,导致特异性阻碍靶标基因表达的现象。由于RNAi诱导基因沉默具有高效性、特异性以及快速简便性等优点,现已成为研究各种生物基因功... 详细信息

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由内源或外源的双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)引发m RNA降解,导致特异性阻碍靶标基因表达的现象。由于RNAi诱导基因沉默具有高效性、特异性以及快速简便性等优点,现已成为研究各种生物基因功能的有力工具,在功能基因研究、基因表达调控、新型农药的开发、害虫防治等领域得到广泛应用。近年来,RNAi机制也被用于开发具有优良性状和抗病毒能力的转基因作物。随着科学家们对植物基因组的深入探索及基因编辑工具的发现,转基因植物技术得到迅猛发展。然而,相关转基因植物的生产和流通也引起了人们关于生物安全问题的担忧。尽管世界各国都在不断完善关于规范转基因产品管理的相关法律法规,但受地区限制、阈值范围、标识制度等因素限制,尚无安全统一的管理体系。因此引入转基因产品中外源成分的检测在转基因生物评价中一直占有重要地位。转基因技术引入的外源DNA含量通常较低,为满足实际样品的分析通常在建立检测体系时引入信号放大策略,可以显著提高分析性能,降低检出限,为电化学DNA传感器的组装和应用提供了新的研究思路。本论文主要将电化学DNA传感器以及CRISPR技术分别结合不同的信号放大策略应用于RNAi相关转基因植物检测分析中,主要研究内容如下:(1)构建了一种基于DNA探针杂交的电化学传感器,实现长双链RNA在转基因玉米叶片中的定量检测。设计了一种新型的三嵌段DNA捕获探针,并对金电极表面进行了功能修饰。为了减少电极表面不必要的非特异性吸附,杂交前用6-巯基己醇封闭电极表面的结合位点。用计时电流法监测电化学信号。X射线光电子能谱表征了电极界面的成功修饰和探针杂交。经过一系列的条件优化,我们可以检测到低至10 f M的合成RNA,并且在转基因玉米叶片提取的3637.5ng/μL总RNA中检测到特异性序列,通过PCR方法对实际样品中提取的转基因双链RNA进行定量,验证了该传感器的实用性。因此,本工作提出的电化学DNA传感器为转基因植物的基因灵敏检测开辟了一条新的途径。(2)开发了一种基于CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统结合重组酶聚合酶等温放大(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)的DNA杂交检测体系,实现转基因植物核酸的荧光定量灵敏检测。本实验中,采用一步法对目标序列进行逆转录扩增,通过设计序列特异性的cr RNA引导CRISPR-Cas13a直接检测ds RNA并激活其非特异性切割活性,当检测体系中引入荧光基团标记的信号分子时,可通过荧光分光光度计检测特定波长观察到荧光信号,实现对于不同浓度目标的灵敏检测。在最优条件下,该荧光分析方法的检测范围为100 a M-10 p M,最低检测限为100a M。此外,该方法在实际样品检测中表现出良好的选择性,出色的实用性,分析时间短,在临床检测方面具有广泛应用前景。

关键词： RNAi转基因植物电化学DNA传感器荧光分光光度法 CRISPR 重组酶聚合酶等温扩增

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

直扩RPA核酸即时可视化检测技术研究

直扩RPA核酸即时可视化检测技术研究

引用

作者：张皖静上海师范大学

学位级别：硕士

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合,以代替传统PCR热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术。本研究基于RPA技术建立了转... 详细信息

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合,以代替传统PCR热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术。本研究基于RPA技术建立了转基因玉米TC1507的检测方法,可在36.7℃恒温条件下快速检测到转基因玉米TC1507中的保守区段,具有较好的特异性,其检测灵敏度达到了10-2ng/μL,检测时间只需5分钟,适用于基层实验室及现场快速检测转基因玉米TC1507及其制品;此外,对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SAU),建立了一种基于重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(RPA)快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌基因保守序列设计的2对引物,以金黄色葡萄球菌阳性菌株和其他7种非金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,考察该方法的检测灵敏度和特异性。结果RPA快速检测金黄色葡萄球菌方法仅需5 min,检测灵敏度为101cfu/μL;7种非金黄色葡萄球菌均不能扩增,特异性较强。本研究建立了金黄色葡萄球菌的RPA快速检测方法,具有快速,简单,成本较低等优点,为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一个新的工具;大麦黄花叶病毒(Barley yellow mosaic virus,Ba YMV)是一种在全世界广泛分布并且破坏性极大的植物病毒,可以导致大麦产量骤减以及种质的衰退。为此,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA)。根据Gen Bank数据库中Ba YMV的保守区基因序列,设计RPA特异性引物,采用Ba YMV,Ba MMV,BSMV,BYDV,BYSMV,BMMV,WSBMV,WSMV以及NCMV共8种病毒进行RT-RPA特异性验证;并设计5个模板浓度梯度,验证RT-RPA方法的灵敏性,并对RT-RPA和RT-PCR的灵敏度进行比较。结果显示,建立的RT-RPA检测方法能够从Ba YMV样品中检测到特异性条带;特异性验证试验表明除Ba YMV能检测到特异性条带以外,其他7种病毒均未检测到条带;RT-RPA检测Ba YMV的灵敏度达到10-3ng/μL,且灵敏度高于RT-PCR,检测时间只需8分钟。综上所述,本研究建立的RT-RPA方法检测Ba YMV特异性强,灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。

关键词：重组酶聚合酶等温扩增转基因玉米TC1507 金黄色葡萄球菌大麦黄花叶病毒快速检测

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

食源性致病菌恒温扩增试纸条检测研究

食源性致病菌恒温扩增试纸条检测研究

引用

作者：藏雨轩天津科技大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌是两类严重威胁食品安全的致病菌,由两种致病菌造成的中毒事件较多。目前传统微生物检测鉴定既费时又费力,基于聚合酶链式反应的方法是灵敏度高,但依赖于精密、昂贵的设备和专业操作人员,限制了其应用。本... 详细信息

金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌是两类严重威胁食品安全的致病菌,由两种致病菌造成的中毒事件较多。目前传统微生物检测鉴定既费时又费力,基于聚合酶链式反应的方法是灵敏度高,但依赖于精密、昂贵的设备和专业操作人员,限制了其应用。本研究中建立了重组酶聚合酶恒温扩增（RPA）和试纸条（LF）结合的方法,用于快速检测金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌,该方法操作简便,灵敏度高,特异性强。RPA是一种新型的扩增方法,可以在较低的温度下（37℃～42℃）下,，220min内完成检测,是被称为最接近“等温扩增”的方法。本实验以金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌特异基因为模板设计引物,将正反引物分别标记地高辛（digoxin）和生物素（biotin）,经RPA扩增后生成双标记的DNA产物,其与胶体金或彩色乳胶微球标记的抗digoxin抗体发生相互作用后携带有显色物质,最终可以在LF上出现肉眼可见的结果。本研究对RPA-LF检测金黄色葡萄球菌的条件进行了优化,结果显示RPA扩增金黄色葡萄球菌的最佳条件为40℃扩增10min,灵敏度分析结果显示RPA-LF可检测500 fg DNA和1.2 X 101 CFU/mL金黄色葡萄球菌纯菌液;特异性结果显示RPA-LF特异性良好,对表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肠炎沙门氏菌等均没有交叉反应;利用鸡肉、牛奶、鸡蛋等实际样品检验方法的检测效果,结果显示经过增菌和检测后,在4.5小时内可检出食品样品中1.2×100CFU/mL（g）的金黄色葡萄球菌。本研究同样优化了 RPA-LF检测单增李斯特菌的方法,结果显示RPA扩增单增李斯特菌的最佳条件为39℃扩增10 min;灵敏度分析结果显示RPA-LF可检测300 fg基因组DNA和1.5 X 101CFU/mL单增李斯特菌纯菌液;特异性结果显示RPA-LF未与格氏李斯特菌、西尔李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、霍乱沙门氏菌和志贺氏菌发生交叉反应;用食物样品评估RPA-LF检测效果,结果显示增菌6 h后,检测限为1.5×100CFU/mL（g）。重组聚合酶恒温扩增结合试纸条检测具有快速、高特异性和高灵敏度等优点。实际样品的检测过程仅需4.5～6h,不需要复杂的热循环装置,只需一台简单的数字化水浴锅即可完成检测,同时对操作人员的技术要求不高,非常适用于食品企业和偏远地区致病菌的快速检测。

关键词：金黄色葡萄球菌单增李斯特菌重组酶聚合酶等温扩增试纸条

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒快速、低成本检测体系的开发与评价

基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒快速、低成本检测体系的开...

引用

作者：孔康康河南农业大学

学位级别：硕士

苹果(Malus domesica)在果树产业中,其栽培面积和产量均位于世界前列,主要种植在温带地区,不仅营养价值高,而且能带来很强的经济效益。但是,苹果产业面临着严重的苹果病毒病问题,目前已知苹果病毒病17种,其中以苹果茎痘病毒(Apple stemp... 详细信息

苹果(Malus domesica)在果树产业中,其栽培面积和产量均位于世界前列,主要种植在温带地区,不仅营养价值高,而且能带来很强的经济效益。但是,苹果产业面临着严重的苹果病毒病问题,目前已知苹果病毒病17种,其中以苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)、苹果茎沟病毒(Applestem grooving virus,ASGV)等潜隐性病毒在我国的发生最为普遍。潜隐性病毒一般不会表现明显的症状且无相应的治疗方式,植株一旦感染,终身带毒,无法治愈。因此,加大对植株苗木的检疫力度,及时清除果园病毒植株,是防止病毒病传播最有效的方式。CRISPR-Cas技术是一种新型基因编辑技术,最近研究表明,Cas12a蛋白与特异性靶标结合后,可以激发出其反式切割活性,该活性可对体系里任意ssDNA进行无差别的切割。纳米金颗粒(AuNPs)比色检测是一种简单且廉价的检测形式,AuNPs的聚集将吸收峰移动到更长的波长,并引发颜色的变化。本研究开创性将CRISPR技术和DNA-AuNPs探针结合,依靠Cas12a精准识别靶标,通过制备价格低廉的DNA-AuNPs针来实现对ASGV的可视化检测。具体研究结果如下:1.建立基于CRISPR-Cas12a技术的ASGV荧光检测体系。对比ASGV保守区域选取靶标序列,设计相应的RPA引物和crRNA,对反应体系进行优化,确定最佳反应缓冲液以及Cas12a/crRNA复合物的最佳反应浓度比例,为ASGV可视化检测体系奠定基础。结果表明,Cas12a/crRNA能够识别ASGV特异性位点,激活其反式切割活性,产生与对照组强烈的荧光差值,反应最佳缓冲液是商业NEBuffer2.1,同时当Cas12a/crRNA复合物浓度分别为50 nM和62.5 nM时,Cas12a反式切割活性显著增强,可在30min内快速达到荧光信号峰值。2.建立基于CRISPR-Cas12a技术的ASGV可视化检测体系。通过碱性聚乙二醇(PEG)溶液实现对植物叶片RNA快速提取,制作用于比色检测的DNA-AuNPs探针,探究Linker-ssDNA浓度对DNA-AuNPs交联速度的影响,建立ASGV可视化检测的最佳反应体系。结果表明,加入饱和NaCl溶液可加速DNA1/2-AuNPs混合物交联速度,当Linker-ssDNA浓度大于40nM时,只需1 min即可观察到DNA1/2-AuNPs混合物由红色变为无色。因此,本研究成功建立一种基于CRISPR-Cas12a技术和DNA-AuNPs探针来快速检测ASGV的方法。实际检测应用中,通过对苹果叶片RNA快速提取,将粗提物直接进行RT-RPA扩增,将扩增产物加入到Cas12a/crRNA和50 nM Linker-ssDNA反应体系中,30 min后与等体积的DNA1/2-AuNPs混合,经过短暂离心后来通过观测颜色变化来鉴定阳性病毒植株。3.CRISPR-Cas12a技术对ASGV检测的特异性和灵敏性评估。从田间采集的苹果叶片样品中,随机挑选13份,分别进行CRISPR-Cas12a/AuNPs检测和RT-PCR扩增,对比两种方式检测结果的差异,评估CRISPR-Cas12a/AuNPs对ASGV检测的特异性。在最佳反应条件下,将ASGV病毒标准质粒连续稀释10倍,分别进行CRISPR-Cas12a/AuNPs检测和RT-PCR扩增,确定CRISPR-Cas12a可视化检测的灵敏度。同时,对不同地区的51个商业果园植物样品进行了检测分析,来评估该方法在大田实际检测中的应用性。最终结果表明,该检测方法具有良好的特异性,针对ASGV检测灵敏度为2.5×103 copies/反应,与RT-PCR相比提高100倍,在大田检测中,51份田间样品检测结果与RT-PCR检测结果一致,在田间实际检测中具有很大的应用价值。综上所述,我们建立一种基于CRISPR-Cas12a技术和DNA-AuNPs探针来对ASGV进行可视化检测的方法。该方法为37℃恒温反应条件,并通过RT-RPA极大的提高了灵敏度,该方法实现对叶片粗提物的直接检测,探针具有通用性,不需要昂贵的荧光探针,无需大型检测设备,检测流程简便,可在1h内检测多个样本,其检测下限为2.5 ×103 copies/反应。有良好的特异性和高灵敏度,成本低,效率高,在实际生产中可以检测大量田间样本以及对苹果脱毒苗进行鉴定。

关键词： CRISPR-Cas12a ASGV 重组酶聚合酶等温扩增纳米金比色可视化检测

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：