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重组病毒载体疫苗在兽医学上的应用

湖北畜牧兽医 2000年第4期21卷 39-43页

作者： NaoakiYOKOYAMA 曹军平

自从痘苗病毒作为疫苗首次应用于预防天花以来,人们研制了许多疫苗以预防多种自然界病源的感染,至今已有200多年的历史。疫苗是最价廉高效的兽药,它包括:减毒活疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗。理想的疫苗应能诱导接种动物产生针对某病原... 详细信息

自从痘苗病毒作为疫苗首次应用于预防天花以来,人们研制了许多疫苗以预防多种自然界病源的感染,至今已有200多年的历史。疫苗是最价廉高效的兽药,它包括:减毒活疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗。理想的疫苗应能诱导接种动物产生针对某病原的终生免疫。疫苗不仅用于控制动物出现症状,

关键词：重组病毒载体疫苗疱疹病毒痘病毒腺病毒兽医

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COVID-19核酸疫苗及其纳米递送系统

中国科学：生命科学 2021年第7期51卷 804-818页

作者：杨海银张萌洁翁郁华曹毅黄渊余北京理工大学生命学院前沿交叉科学研究院医工融合研究院分子医学与生物诊疗重点实验室北京100081 湖南科技学院永州425199 南华大学公共卫生学院衡阳421001

2019年末,新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)席卷全球,对全球经济以及人民健康产生了重大影响.根据世界卫生组织的数据,截至2021年3月1日,全球确诊人数已超1亿,死亡人数更超2百多万.幸运的是,目前已有多种针对COVID... 详细信息

2019年末,新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)席卷全球,对全球经济以及人民健康产生了重大影响.根据世界卫生组织的数据,截至2021年3月1日,全球确诊人数已超1亿,死亡人数更超2百多万.幸运的是,目前已有多种针对COVID-19的疫苗获得紧急使用授权,其中包括两种mRNA疫苗、多款灭活疫苗及病毒载体疫苗.核酸疫苗包括m RNA疫苗和DNA疫苗,相比于传统的疫苗,它们的开发速度、生产方式、制造成本及应对突变型毒株的灵活性等在本次新型冠状病毒肺炎疫情中显示出了明显优势.本文将对两种核酸疫苗和重组病毒载体疫苗的作用方式及其纳米递送系统进行综述,并对现阶段核酸疫苗领域所面临的挑战和未来的研究方向进行展望.

关键词：新型冠状病毒肺炎 mRNA疫苗 DNA疫苗重组病毒载体疫苗纳米递送系统

SARS-CoV刺突蛋白嵌合型重组VSV的构建与免疫原性研究

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SARS-CoV刺突蛋白嵌合型重组VSV的构建与免疫原性研究

作者：汤筱艳中国农业科学院

学位级别：硕士

重症急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)是由重症急性呼吸综合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)引起的一种急性,发热,并伴有呼吸道感染等严重并发症的致死性传染病。该病传播速度快、死亡率高,且尚无有效的抗病毒药物和商业化疫苗。虽然从2004年以来没有新的SARS感染病例报道,但是该病仍然有再次流行的可能,进而严重威胁民众的健康。2019年12月我国湖北省武汉市爆发了由SARS-CoV-2引起的COVID-19疫情,研究表明该病毒是一种类SARS样新型冠状病毒,说明SARS-CoV依然存在突破物种屏障并通过中间宿主传染给人类的潜在危险,因此研发SARS-CoV储备型疫苗对我国防控SARS具有十分重要的意义。SARS-CoV是冠状病毒科(Coronaviridae)、β-冠状病毒属(β-Coronavirus)成员。刺突蛋白(Spike protein,S)是SARS-CoV的跨膜糖蛋白,主要负责与细胞受体结合、诱导病毒与细胞融合以及刺激机体产生免疫应答等,是SARS-CoV最重要的免疫原性蛋白。水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)是弹状病毒科(Rhabdoviridae)、水泡病毒属(Vesiculovirus)成员。VSV作为重组病毒疫苗载体具有很多优点:VSV是一种RNA病毒,其基因组不会整合到宿主细胞中;VSV增殖速度快、滴度高,单次免疫就能产生有效保护;插入的外源基因稳定并且表达效率高;VSV对普通人群的致病性极低,具有较高的安全性。本研究以实验室成功构建的嵌合型VSV反向遗传操作系统为基础,将VSV的嚢膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)替换为SARS-CoV S蛋白,成功拯救出重组病毒并分别命名为VSVΔG-SARS和VSVΔG-eGFP-SARS。Western blot和激光共聚焦实验证明重组病毒可以正确表达SARS-CoV S蛋白,间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)结果显示重组病毒依赖宿主细胞的细胞受体血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)完成入侵,进一步表明SARS-CoV S蛋白在重组病毒中成功表达。通过电镜发现重组病毒呈现弹状病毒的典型形态,同时S蛋白嵌合在重组病毒嚢膜表面。病毒的生长动力曲线结果表明重组病毒的滴度低于亲本毒wtVSV,但仍然可以满足免疫滴度的需要。在小鼠的安全评价实验中小鼠未表现出任何临床症状,初步说明重组病毒对小鼠具有良好的安全性。在免疫效力评价中,首先通过中和试验和ELISA实验证明重组病毒能刺激小鼠产生较高水平的体液免疫,进一步通过ELISPOT实验证明重组病毒也可以诱导恒河猴较强的细胞免疫应答,表明重组病毒具有良好的免疫原性。本研究利用VSV嵌合型反向遗传系统,成功制备了嵌合型重组病毒VSVΔG-SARS和VSVΔG-eGFP-SARS,并利用小鼠和恒河猴对VSVΔG-SARS的免疫原性进行评估,证明该重组病毒具有作为SARS-CoV储备型疫苗的潜在价值,同时也为研发以VSV为载体SARS-CoV-2的疫苗提供了可行性。

关键词：水泡性口炎病毒重症急性呼吸综合征病毒刺突蛋白囊膜糖蛋白重组病毒载体疫苗

表达鹅星状病毒Cap蛋白重组鸭瘟病毒的构建及生物学特性的研究

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表达鹅星状病毒Cap蛋白重组鸭瘟病毒的构建及生物学特性的研究

作者：倪捷中国农业科学院

学位级别：硕士

2016年以来,我国多地区爆发一种由鹅星状病毒(Goose astrovirus,Go Ast V)引起以内脏尿酸盐沉积为特征的鹅新发传染病,俗称鹅痛风病。该病主要在3周龄以内的雏鹅上发生,病程通常为7～10 d,死亡率可高达50%。患病鹅表现为卧地不起、精神... 详细信息

2016年以来,我国多地区爆发一种由鹅星状病毒(Goose astrovirus,Go Ast V)引起以内脏尿酸盐沉积为特征的鹅新发传染病,俗称鹅痛风病。该病主要在3周龄以内的雏鹅上发生,病程通常为7～10 d,死亡率可高达50%。患病鹅表现为卧地不起、精神萎靡、食欲不振、拉白色稀便,耐过鹅生长和发育受到严重影响。剖解在胆囊、心脏、肝脏以及胃部等器官可见肿胀和尿酸盐沉积。近年来该病呈现流行趋势,严重阻碍了我国鹅养殖业的健康发展,造成了巨大经济损失。目前,我国针对鹅痛风病防控主要依赖于卵黄抗体的注射治疗。然而,该方法需要多次注射,导致人工成本高、易造成各种病原体的扩散传播而带来额外的风险。同时由于缺乏适合鹅星状病毒生长增殖的体外培养系统,导致研发针对鹅星状病毒的传统灭活疫苗和减毒活疫苗较为困难。因此,寻求一种更为高效、安全可靠的新型疫苗是当前亟待解决的问题。鸭瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)是疱疹病毒科(Hepesviridae)、α-疱疹病毒亚科马立克病毒属(Mardivirus)成员,其基因组容量大,可插入多个外源基因,该病毒刺激免疫应答快,呈现出良好的免疫保护效果,同时可以在鸡成纤维细胞上培养,并将病毒粒子释放至上清中,制备简单,容易保存,是一个良好的病毒载体。鉴于此,本研究构建了表达鹅星状病毒主要抗原Cap蛋白的重组鸭瘟病毒,对重组病毒增殖特性、外源蛋白表达、稳定性等生物学特性进行研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑和同源重组技术,本研究成功构建了表达鹅星状病毒Cap蛋白和Cap-HA2蛋白(HA2可帮助形成多聚体)的重组鸭瘟病毒,分别命名为Vac-Cap、Vac-Cap-HA2。本研究利用原核表达系统制备了鹅星状病毒Cap蛋白,纯化后免疫小鼠,制备了多抗血清。使用此多抗血清作为一抗,通过间接免疫荧光的方法对重组病毒表达外源蛋白的情况进行鉴定,结果显示这两株重组病毒均能表达鹅星状病毒Cap蛋白,表达的Cap蛋白主要分布在细胞质中,与Go Ast V自然感染后Cap蛋白的细胞分布相似。将两株重组病毒连续传10代后进行测序分析,并检测蛋白表达情况,发现传代重组病毒中插入片段无突变或缺失,外源蛋白的表达没有明显变化,表明该病毒至少可以稳定传10代。为比较两株重组病毒和亲本病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的生长特性是否存在差异,分别将三种病毒以MOI=0.001剂量接种CEF细胞,在接种后24h、48 h、72 h、96 h时间点取样,滴定病毒滴度,绘制生长曲线,研究结果发现两株重组病毒Vac-Cap、Vac-Cap-HA2在各时间点的病毒滴度与亲本鸭瘟病毒无显著差异,在感染细胞72 h时,Vac-Cap病毒滴度达到10TCID/100μL,Vac-Cap-HA2病毒滴度达到10TCID/100μL,鸭瘟疫苗株Vac病毒滴度达到10TCID/100μL。本实验成功构建了两株表达鹅星状病毒Cap蛋白的重组鸭瘟病毒,并对其生物学特性进行了研究,为鹅星状病毒新型重组病毒载体疫苗的研制提供了毒株基础。

关键词：鹅星状病毒鸭瘟病毒 CRISPR/Cas9 重组病毒载体疫苗生物学特性

表达狂犬病病毒糖蛋白重组9型腺相关病毒的构建与免疫原性研究

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表达狂犬病病毒糖蛋白重组9型腺相关病毒的构建与免疫原性研究

作者：朱业蕾山东大学

学位级别：硕士

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种古老的急性、高致死性人兽共患病。全球平均每年仍有大约55,000人死于狂犬病,我国是狂犬病的高发区。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病病毒属成员,具有强烈的嗜神经性,一... 详细信息

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种古老的急性、高致死性人兽共患病。全球平均每年仍有大约55,000人死于狂犬病,我国是狂犬病的高发区。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病病毒属成员,具有强烈的嗜神经性,一旦发病病死率几乎为100%。疫苗免疫是目前防治狂犬病最为有效的方法。但目前的疫苗存在免疫程序复杂、免疫后抗体产生迟缓,抗体维持时间短等缺点,亟待研制新型狂犬病疫苗。9型腺相关病毒(Adeno-associated virus type 9,AAV9)为细小病毒家族依赖病毒属的缺陷型病毒,其作为基因工程疫苗载体具有安全性高、可持续表达外源基因等优点,具有极低的免疫原性和毒性的同时,穿透血脑屏障的能力较强。本研究将狂犬病病毒主要保护性抗原G蛋白基因重组至9型腺相关病毒,获得重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。通过体外细胞实验、动物免疫及攻毒保护实验,分析G蛋白表达情况,评价其免疫原性和保护性。目的1.采用9型腺相关病毒作为载体,插入狂犬病病毒SRV9毒株G蛋白基因,构建表达狂犬病病毒G蛋白的重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。2.通过体外细胞实验检测rAAV9-GFP-RABVG在细胞水平上能否表达RABV G蛋白;通过动物免疫实验检测rAAV9-GFP-RABVG的免疫原性和保护性,为新型重组狂犬病疫苗的研制提供科学依据。方法1.构建表达狂犬病病毒G蛋白的9型腺相关病毒载体重组病毒rAAV9-GFP-RABVG,体外感染293T细胞,通过间接免疫荧光实验和Western blot检测狂犬病病毒G蛋白的表达情况。2.6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,监测小鼠体重、饮食、毛色状态,持续21天,通过小鼠体重变化及小鼠状态初步评价重组病毒疫苗的安全性。3.6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,在免疫后第2、4、8、12、24周采血,分离外周血清,利用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测病毒中和抗体(VNA)效价,获得中和抗体的持续期和消长变化规律。4.通过流式细胞术检测rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠募集和/或活化B、T、DCs细胞的情况。5.使用ELISpot检测试剂盒检测特异性刺激物存在时rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞分泌细胞因子IFN-y和IL-4的能力。6.使用ELISA试剂盒检测特异性刺激物存在时rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平。7.攻毒保护实验。6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG后21天,异侧后肢骨骼肌注射HuPBN3株狂犬病病毒,记录攻毒后21天内小鼠状态及死亡情况,取死亡小鼠脑组织进行RT-PCR,检测rAAV9-GFP-RABVG能否保护小鼠免于狂犬病病毒致死剂量的攻击。结果1.间接免疫荧光及Western blot实验检测到狂犬病病毒G蛋白在细胞水平上的表达,且分子量约为70kD,与预期大小相符。2.与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG重组病毒组小鼠体重变化轻微,未出现异常行为或神经症状。3.对免疫小鼠血清中和抗体水平检测结果显示,与对照组AAV9-GFP相比,rAAV9-GFP-RABVG能诱导小鼠产生强烈的RABV中和抗体,免疫后2周达到13.66IU/ml,第8周达到峰值,且免疫后24周仍保持较高水平。4.流式细胞术结果显示,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG能诱导小鼠募集和/活化更多的B细胞(CD19+CD40+双阳性)和DCs(CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+MHC Ⅱ+双阳性)细胞,小鼠脾中抗原特异性分泌IFN-γ和IL-4的CD4+T细胞和抗原特异性分泌IFN-γ的CD88+细胞显著增多。***-γ ELISpot和IL-4 ELISpot检测结果趋势相似,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG刺激小鼠脾淋巴细胞产生的斑点形成细胞(SFCs)数目显著增多。***结果显示,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞抗原特异性分泌的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ显著增多。7.攻毒保护实验结果显示,攻毒后观察期结束时空白组及AAV-GFP对照组的小鼠出现典型狂犬病症状,且存活率均为0%。rAAV9-GFP-RABVG重组病毒组小鼠观察期内未出现任何狂犬病症状,观察期结束时组内小鼠存活率为100%。空白组和AAV9-GFP对照组死亡小鼠脑组织的RT-PCR结果

关键词：狂犬病病毒狂犬病病毒糖蛋白G 腺相关病毒重组病毒载体疫苗

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艾滋病疫苗研制进展情况

致富天地 2005年第7期 8-8页

作者：柯学志

人类有一个愿望，希望能研制出像预防天花、肺结核等疾病那样的艾滋病疫苗。为此，各国的科学家和艾滋病防治专家正夜以继日地努力着。可惜，多年过去了，进展仍十分缓慢。目前，“鸡尾酒”疗法仍然被认为是治疗艾滋病最有效的方法。这... 详细信息

人类有一个愿望，希望能研制出像预防天花、肺结核等疾病那样的艾滋病疫苗。为此，各国的科学家和艾滋病防治专家正夜以继日地努力着。可惜，多年过去了，进展仍十分缓慢。目前，“鸡尾酒”疗法仍然被认为是治疗艾滋病最有效的方法。这一方法是于1996年由美国的何大一博士率先提出的，被称之为高效抗病毒疗法，它大大减低了艾滋病患者的死亡率，

关键词：艾滋病疫苗 I期临床试验自主知识产权 DNA疫苗重组病毒载体疫苗中国