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生物技术 2024年第4期 407-411+438页

作者：支旭勃陈款民王昭维李倩楠孙雪嫄张芷萌杨影李元陕西慧康生物科技有限责任公司

[目的]构建人SNARE复合物中的SNAP25、Syntaxin 1a和VAMP1蛋白真核表达载体，并于体外进行表达纯化。[方法]将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经抗性和蓝白斑筛选，获得重组杆粒；用脂质体转化法，将重组杆粒转染至Sf9昆虫... 详细信息

[目的]构建人SNARE复合物中的SNAP25、Syntaxin 1a和VAMP1蛋白真核表达载体，并于体外进行表达纯化。[方法]将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经抗性和蓝白斑筛选，获得重组杆粒；用脂质体转化法，将重组杆粒转染至Sf9昆虫细胞中使其产生重组病毒，最后对病毒进行扩增后再感染Sf9昆虫细胞表达目的蛋白；所得蛋白进行Western Blot鉴定及纯化。[结果]测序结果表明SNAP25、Syntaxin 1a和VAMP1真核表达载体构建成功，Western Blot检测出三种蛋白的特异性条带，利用His标签蛋白纯化出Syntaxin 1a蛋白。[结论]利用杆状病毒表达系统成功表达出了SNARE复合物相关蛋白。

关键词： SNARE复合物 SNAP25蛋白 Syntaxin 1a蛋白 VAMP1蛋白重组杆粒杆状病毒 Sf9昆虫细胞蛋白纯化

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COVID-19病毒N基因在昆虫细胞内的表达

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华北农学报 2022年第5期37卷 174-180页

作者：宿放韩佃刚叶玲玲张冲尹尚莲罗倩敏董仙兰李瑶瑶李凌枫艾军信吉阁云南农业大学动物医学院云南昆明650201 昆明海关云南昆明650200

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中,首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白(N蛋白)序列,将pFastBacHTB载体上的酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ分别加入上下游引物,利用PCR... 详细信息

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中,首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白(N蛋白)序列,将pFastBacHTB载体上的酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ分别加入上下游引物,利用PCR技术对N基因进行扩增,先后连接T-Vector pMD19(simple)载体与pFastBacHTB载体,并获得重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N和pFastBacHTB-COV19-N,最终在DH10Bac细胞中构建重组杆粒DH10Bac-pFastBacHTB-COV19-N并使其在昆虫细胞Sf9内进行表达,获得重组蛋白后进行SDS-PAGE和WB分析。通过PCR方法成功扩增N基因,构建的重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N经PCR和双酶切鉴定均证明正确,在DH10Bac细胞内构建的重组杆粒DH10Bac-pFastBacHTB-COV19-N通过PCR鉴定得到预期2条带,大小分别为2430,3690 bp,证明成功得到重组杆粒,用该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,同时设立重组GFP蛋白对照组,转染120 h后分别收集重组N蛋白与重组GFP蛋白并制样;分别进行SDS-PAGE和WB分析,使用HRP-His标记抗体验证转染成功且重组N蛋白与重组GFP蛋白均在Sf9细胞内顺利表达,试验结果与预期相符,重组N蛋白条带大小约为46 ku。该试验成功构建了呼吸道冠状病毒N基因真核表达载体,并在昆虫细胞内成功表达,为建立ELISA检测方法等相关研究提供试验基础。

关键词： COVID-19病毒 N蛋白昆虫表达系统重组杆粒蛋白鉴定

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人源性促甲状腺激素受体单链抗体Fc融合蛋白的制备及鉴定

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中国免疫学杂志 2020年第14期36卷 1720-1723页

作者：吴黎黎贾健安邵璇璇黄保军(指导) 安徽医科大学免疫教研室合肥230001 中国人民解放军联勤保障部队第901医院检验科合肥230001

目的:构建含有促甲状腺激素受体抗体(TRAb)单链抗体的重组载体pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc,通过Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达,并检测目的蛋白表达和免疫学活性。方法:TRAb抗体的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的序列... 详细信息

目的:构建含有促甲状腺激素受体抗体(TRAb)单链抗体的重组载体pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc,通过Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达,并检测目的蛋白表达和免疫学活性。方法:TRAb抗体的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的序列以linker(G4S)连接,构建ScFv;Genbank检索人IgG1Fc序列,SnapGene软件分析上述序列和载体pFastBacTM1,以基因合成方式构建重组质粒pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc;pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc转化感受态大肠杆菌DH10Bac生成重组杆粒,pUC/M13正向和反向引物进行PCR分析确认目的基因的序列;重组杆粒采用Cellfectin®Ⅱ试剂转染昆虫细胞Sf9生成P1病毒储液,继续感染Sf9生成高滴度的P2和P3病毒储液;P3病毒储液感染High FiveTM细胞,收集上清通过SPA-Sepharose CL-4B亲和层析纯化获得较纯的单链抗体融合蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白;化学发光和免疫组化检测目的蛋白抗原结合力。结果:PCR扩增得到约3747 bp的基因序列,重组杆粒中目的基因正确插入;目的蛋白位于55 kDa附近且无杂带,纯度较高;目的蛋白浓度为248 U/L,单链抗体融合蛋白的结合力较好。结论:Bac-to-Bac表达系统成功构建并表达了TRAb单链抗体融合蛋白,抗原亲和力良好。

关键词：促甲状腺激素受体抗体单链抗体昆虫细胞重组质粒重组杆粒

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表达鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S和N蛋白的重组杆状病毒的构建

表达鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S和N蛋白的重组杆状病毒的构建

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作者：孙新宽广西大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种高度接触性传染病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV基因组易发生变异和重组,从而产生多种血清型或变异型。... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种高度接触性传染病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV基因组易发生变异和重组,从而产生多种血清型或变异型。临床上用于预防IB的常规疫苗即弱毒苗和灭活苗在效果、安全和成本方面都存在缺陷,因此研制高效、安全、廉价的新型疫苗显得非常重要。IBV结构蛋白中S1和N蛋白是主要免疫原,分别在体液免疫和细胞免疫中发挥重要作用,因此研发包括S1和N蛋白的新型疫苗具有良好的应用前景。昆虫杆状病毒表达系统作为一种成熟的表达系统,在外源蛋白的表达中具有重要的作用,该系统具有良好的翻译后加工能力,可以对重组外源蛋白进行信号肽剪切、糖基化修饰等。相关研究表明,应用杆状病毒表达系统时引入昆虫细胞能识别和剪切的蜂素(Honeybee melittin,HBM)信号肽能够介导外源蛋白以分泌表达的形式存在于培养上清,同时能够增强重组蛋白的表达量及糖基化修饰,表达的重组蛋白更接近天然构象。目前杆状病毒表达系统在IBV的应用只是对单个蛋白进行表达,尚没有对S1和N蛋白进行共表达的研究,并且表达产物在分子量大小、生物活性和分泌性表达方面往往存在缺陷。因此分泌表达结构和功能接近于天然蛋白的S1和N蛋白非常重要。本研究应用昆虫杆状病毒表达系统对广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的S1和N蛋白进行单表达或共表达的研究,引入了昆虫细胞可识别的HBM信号肽,并在C端融合6个组氨酸标签和TEV蛋白酶切位点以利于后期蛋白的纯化。具体如下:一、扩增IBV的N基因和HBM信号肽,融合扩增获得HBM-N,克隆后经PCR、酶切和测序验证后,定向亚克隆至双元转座载体pFastBacDual,转化DH1OBac进行转座后筛选纯化获取含有HBM-N基因的重组杆粒rHBM-N。二、扩增HBM信号肽、S1、S基因和去除自身信号肽的S1及S基因;HBM与去除信号肽的S和S1基因进行融合,获得HBM-S1和HBM-S。HBM-S1、HBM-S及携带自身信号肽的S1、S基因经克隆鉴定正确后,亚克隆至pFastBacDual,经PCR、酶切和测序验证,表明获得携带HBM信号肽的S1和S基因和携带其自身信号肽S1和S基因的重组转座载体,分别转化DH1OBac,筛选获得融合HBM的重组杆粒rHBM-S、rHBM-S1及携带其自身信号肽的重组杆粒r-S和r-S1。三、将HBM-S1基因定向插入鉴定正确的pFast-HBM-N重组转座载体PH启动子下游,经PCR、酶切和测序鉴定,获得重组双元转座载体pFast-HBM-S1-N,转化DH10Bac转座后PCR鉴定获得纯化的共表达S1和N蛋白的重组杆粒rHBM-S1-N。本研究共构建六个重组杆状病毒的表达载体,为下一步单表达或共表达IBV的S1和N蛋白打下基础,为S和N蛋白生物学功能、病毒变异、致病机制、诊断抗原和新型疫苗的研究等奠定基础,也为研究HBM对IBV结构蛋白表达的影响提供证据。本研究的创新点是首次应用杆状病毒表达系统对IBV的主要保护性抗原S1蛋白和在细胞免疫中起重要作用且保守的N蛋白进行共表达研究,并且引入了昆虫细胞可识别的HBM信号肽,旨在使重组蛋白高效、分泌性表达且具有天然蛋白活性;为下一步高效新型基因工程疫苗和诊断抗原的研制奠定基础。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 S蛋白 N蛋白构建重组杆粒

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