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重组人白细胞介素-6在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

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重组人白细胞介素-6在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

作者：张德芳厦门大学

学位级别：硕士

白细胞介素-6主要由T细胞、淋巴样细胞、角质细胞、内皮细胞、纤维原细胞以及单核细胞等在活化状态时分泌产生的,属于多效应的细胞因子。1986年,IL-6基因结构被阐明,并于当年第六界免疫学大会上被命名为白细胞介素-6。[1,2]。IL-6主要... 详细信息

白细胞介素-6主要由T细胞、淋巴样细胞、角质细胞、内皮细胞、纤维原细胞以及单核细胞等在活化状态时分泌产生的,属于多效应的细胞因子。1986年,IL-6基因结构被阐明,并于当年第六界免疫学大会上被命名为白细胞介素-6。[1,2]。IL-6主要以自分泌或旁分泌方式发挥效应。它对其他细胞因子有调节作用[3],在急性期反应、造血调节、免疫应答中发挥极其重要作用,它能激活靶基因,不但能作为内皮细胞、B细胞、T细胞、造血源细胞、破骨细胞等细胞的生长与分化因子,而且对中枢与外周的神经系统细胞的生长、分化、再生与降解发挥重要的作用。IL-6可以恢复并强化体内造血功能,在体内能够明显刺激血小板的产生[4’5]。另一方面,IL-6过量表达往往与某些疾病有关(Keto等,1997)[6]。总之,IL-6对放疗、化疗所致血小板减少,肿瘤、肝损伤等研究和治疗相关方面有着潜在的广泛应用前景。本文采用基因工程技术,构建能够高效表达重组人白细胞-6(rhIL-6)的表达菌株,在中试规模下,高密度地发酵表达目的蛋白并分离纯化,获得高活性、纯度较高的rhIL-6,并对其相关理化性质进行分析。根据人白细胞介素IL-6氨基酸序列,采用大肠杆菌的偏好密码子设计出核酸序列与引物,通过PCR扩增技术得到rhIL-6的全序列cDNA。选用pColdⅡ表达载体,将外源rhIL-6基因插入到表达载体pColdⅡ的多克隆位点,通过转化进入大肠杆菌BL21感受态细胞,得到高表达的大肠杆菌菌株。rhIL-6重组菌株进行发酵培养表达,选用的发酵罐规模为200 L,使用的蛋白表达诱导物为IPTG。含rhIL-6融合蛋白的发酵液经离心收集菌体,菌体破碎收集包涵体,然后包涵体进行变性、亲和层析捕获和复性,获得融合蛋白;融合蛋白经层析脱盐、肠激酶(EK酶)酶切、亲和层析、体积排阻层析等纯化步骤,获得高活性、纯度较高的原液rhIL-6。为验证和控制rhIL-6的质量,本文采用B9-11细胞增殖法测定rhIL-6活性,SDS-PAGE电泳和HPLC-SEC法对终产品纯度进行分析,质谱法对分子量进行分析,Edman降解法进行N端分析。结果表明,rhIL-6原液的比活性为0.97X 107IU/mg;HPLC-SEC纯度为87%,SDS-PAGE电泳纯度大于95%;质谱法分析rhIL-6的分子量为20894 Da,与理论分子量一致;确认N端正确。综上所述,我们利用现代基因工程技术实现了重组人白细胞介素-6在大肠杆菌中的高效表达,建立了重组人白细胞介素-6的发酵和纯化工艺,并完成其理化性质的分析,为推进其工业化生产奠定了基础。

关键词：重组人白细胞介素-6 基因表达纯化和鉴定

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重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究

化学工业与工程 2000年第6期17卷 321-325页

作者：吴蕾张瑛甘一如孙江莉张浩森天津大学化工学院天津300072

本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L... 详细信息

本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0

关键词：重组人白细胞介素-6 包含体溶解

重组人白细胞介素-6的制备及其对豚鼠辐射损伤的保护作用

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中国辐射卫生 2002年第3期11卷 137-138页

作者：王郡甫张捷张建华冯进波徐洁王宝红山东省医学科学院基础医学研究所山东济南250062 临沂市中医院

目的　利用工程菌E .coliDH5αPBV2 2 0 IL6制备重组人白细胞介素 6,并探讨白细胞介素 6对辐射豚鼠的生存期和血小板数的影响。方法　将IL -6工程菌诱导表达、纯化后应用于辐射豚鼠的治疗。结果　纯化的IL -6对辐射豚鼠的生存期和血小... 详细信息

目的　利用工程菌E .coliDH5αPBV2 2 0 IL6制备重组人白细胞介素 6,并探讨白细胞介素 6对辐射豚鼠的生存期和血小板数的影响。方法　将IL -6工程菌诱导表达、纯化后应用于辐射豚鼠的治疗。结果　纯化的IL -6对辐射豚鼠的生存期和血小板数有明显的提高作用。结论　IL -6对辐射豚鼠具有明显的保护作用。

关键词：重组人白细胞介素-6 辐射损伤保护作用制备方法生存期血小板

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重组人白细胞介素-6补料分批发酵工艺研究

发酵科技通讯 2009年第4期38卷 23-24页

作者：潘显玲崔进梅张廷文山东泉港药业有限公司 250011 山东省产品质量监督检验所 250100

在传统分批发酵工艺的基础上,对***表达IL,-6的补料分批发酵工艺进行研究,结果表明:在发酵诱导期间补料可在表达纯度相差无几的情况下提高菌体的产量,最终提高了生产效率,降低了成本。两次发酵结果如下,分批补料工艺菌体生物量为12.4g/L... 详细信息

在传统分批发酵工艺的基础上,对***表达IL,-6的补料分批发酵工艺进行研究,结果表明:在发酵诱导期间补料可在表达纯度相差无几的情况下提高菌体的产量,最终提高了生产效率,降低了成本。两次发酵结果如下,分批补料工艺菌体生物量为12.4g/L,SDS-PAGE电泳法测IL-6表达量为40%,显然比分批发酵8.3g/L的菌体生物量及38%的纯度提高49.4%和5.0%。

关键词：重组人白细胞介素-6 补料分批发酵分批发酵表达

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重组人白细胞介素-6补料分批发酵工艺研究

山东轻工业学院学报（自然科学版） 2003年第2期17卷 40-42页

作者：潘显玲崔进梅张廷文刘应军山东泉港药业有限公司山东济南250014 山东省产品质量监督检验所山东济南250100

在传统分批发酵工艺的基础上,对***表达IL-6的补料分批发酵工艺进行研究,结果表明:在发酵诱导前补料可在表达纯度相差无几的情况下提高菌体的产量,最终提高了生产效率,降低了成本。通过几次发酵比较,结果如下:分批补料工艺菌体生物量平... 详细信息

在传统分批发酵工艺的基础上,对***表达IL-6的补料分批发酵工艺进行研究,结果表明:在发酵诱导前补料可在表达纯度相差无几的情况下提高菌体的产量,最终提高了生产效率,降低了成本。通过几次发酵比较,结果如下:分批补料工艺菌体生物量平均为10.8g/L,SDS-PAGE电泳法测IL-6表达量平均为40%,比分批发酵8.3g/L的菌体生物量及3.5%的纯度提高30.1%和3.9%。

关键词：重组人白细胞介素-6 补料分批发酵工艺 IL-6表达量产量药物

重组人白细胞介素-6层析穿流液回收处理工艺研究

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中国药业 2007年第6期16卷 44-45页

作者：黄凯深圳致君制药有限公司广东深圳518029

目的采用中低压液相层析分离纯化重组人白细胞介素(rhIL-6),回收处理废液以提高产品收率。方法采用阴离子层析介质Q-sepharose FF和Q-sepharose HP纯化大肠杆菌来源的rhIL-6。结果所得纯品经高效液相色谱法和SDS-PAGE分析表明,纯度大于9... 详细信息

目的采用中低压液相层析分离纯化重组人白细胞介素(rhIL-6),回收处理废液以提高产品收率。方法采用阴离子层析介质Q-sepharose FF和Q-sepharose HP纯化大肠杆菌来源的rhIL-6。结果所得纯品经高效液相色谱法和SDS-PAGE分析表明,纯度大于95%,rhIL-6收率为14%。结论对Q-sepharose FF层析的穿流液进行超滤浓缩、变性、复性处理,再进行层析可提高rhIL-6的收率。

关键词：重组人白细胞介素-6 收率穿流液回收

聚乙二醇化重组人白细胞介素6工作标准品的研制

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聚乙二醇化重组人白细胞介素6工作标准品的研制

重组人IL-6对不同类型原代白血病细胞增殖作用的影响

2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会

作者：袁涛张珂李征王智杰邓杰周宇赵兆李晓容曾海鹏饶海林张雪梅中国医药集团成都生物制品研究所

目的:为了准确评价聚乙二醇化重组人白细胞介素6(PEGylated recombinant interleukin-6,PEG-rhIL-6)中试制备工艺,分别制备重组人白细胞介素6(recombinant interleukin-6,rhIL-6)和PEG-rhIL-6理化对照品和冻干体外生物学活性工作标准品用于评价制备过程各步样品纯度、理化指标及体外生物学活性。方法:制备纯化的rhIL-6和PEGrhIL-6样品,经适当稀释分装后对其进行全面检定,作为理化对照品。另将一部分精确定量的rhIL-6用含冻干保护剂的缓冲液稀释分装冻于,制成冻干制品后对其进行全面检定和稳定性考察,达到要求后可作为体外生物学活性工作标准品。结果:两种理化对照品和冻干体外生物学活性工作标准品各项常规检测指标均符合暂定规程要求;两种理化对照品结构分析结果证实与理论值相符;冻干体外生物学活性工作标准品加速稳定试验证明其体外活性稳定。结论:制备的两种理化对照品和冻干体外生物学活性工作标准品可用于PEG-rhIL-6中试工艺的研究和评价。

关键词：聚乙二醇化重组人白细胞介素-6 理化对照品体外生物学活性测定工作标准品

来源： cnki会议评论

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山东医药 2004年第7期44卷 35-36页

作者：朱宏丽卢学春范辉庄晓萌姚善谦中国人民解放军总医院北京100853

骨髓抑制是白血病患者加强化疗剂量的重要制约因素之一.严重长时间骨髓抑制所产生的并发症是白血病化疗及造血干细胞移植预处理后进行序贯治疗的障碍.目前,对恶性血液病患者化疗后的骨髓抑制,临床上主要采用粒细胞刺激因子(G-CSF)、促... 详细信息

骨髓抑制是白血病患者加强化疗剂量的重要制约因素之一.严重长时间骨髓抑制所产生的并发症是白血病化疗及造血干细胞移植预处理后进行序贯治疗的障碍.目前,对恶性血液病患者化疗后的骨髓抑制,临床上主要采用粒细胞刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和白介素11(IL-11)等用于刺激骨髓造血.但上述药物的作用谱相对较窄,同时有促进白血病细胞增殖的顾虑,人重组IL-6(rhL-6)具有促进骨髓造血恢复和功能重建的应用前景[1,2].

关键词：重组人白细胞介素-6 原代白血病细胞细胞增殖促红细胞生成素粒细胞刺激因子

二甲双胍抑制IL-6激活JAK/STAT3信号通路诱导的Hela细胞上皮-间质转化的研究

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二甲双胍抑制IL-6激活JAK/STAT3信号通路诱导的Hela细胞上皮-间质...

作者：汤轶南华大学

学位级别：硕士

目的:研究二甲双胍联合重组人白细胞介素-6(Human recombinant IL-6)经JAK/SATA3信号通路对宫颈癌Hela细胞上皮-间质转化的抑制作用,并分析其机制。方法:1.体外37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养宫颈癌Hela细胞;2.不同浓度的IL-6、二甲双... 详细信息

目的:研究二甲双胍联合重组人白细胞介素-6(Human recombinant IL-6)经JAK/SATA3信号通路对宫颈癌Hela细胞上皮-间质转化的抑制作用,并分析其机制。方法:1.体外37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养宫颈癌Hela细胞;2.不同浓度的IL-6、二甲双胍在不同时间点处理Hela细胞,通过CCK-8法筛选出IL-6、二甲双胍的最佳作用浓度及时间;3.将实验分为对照组、IL-6组、二甲双胍组及IL-6+二甲双胍组,用筛选出的IL-6、二甲双胍的作用浓度及及时间处理Hela细胞;4.倒置显微镜下观察各组细胞形态变化;***/EB荧光双染色法观察各组细胞凋亡、坏死情况;*** Blot检测各组细胞p-STAT3蛋白、Twist蛋白及E-cadherin蛋白变化;***-PCR检测各组细胞Twist mRNA、E-cadherin mRNA变化。结果:***-8结果表明IL-6及二甲双胍的最佳作用浓度分别为50ng/ml、10mmol/L,最佳作用时间为48h;2.观察发现对照组细胞表现出典型的上皮细胞特性,呈椭圆形,紧密排列;IL-6组细胞呈间质细胞表型改变,间隙明显增宽,细胞呈纺锤状和长梭形,排列散乱;二甲双胍组细胞形态圆形,细胞成团堆积,较多坏死细胞漂浮;il-6+二甲双胍组细胞形态圆形、长梭形,细胞核疏松,坏死细胞明显增多,成团漂浮;***/eb荧光双染色发现对照组、il-6组只有少量细胞凋亡,二甲双胍组有较多细胞凋亡,而il-6+二甲双胍组几乎全为凋亡细胞,细胞成片漂浮。统计各组细胞凋亡、坏死率发现,il-6+二甲双胍组细胞凋亡、死亡率明显多于其他各组,差异有统计学意义(p6组较对照组p-stat3蛋白(1.54±0.41vs1.00±0.00)、twist蛋白(1.61±0.08vs1.00±0.00)表达量明显增加、e-cadherin蛋白(0.63±0.02vs1.00±0.00)表达量下降,差异有统计学意义(p0.05);il-6+二甲双胍组较对照组p-stat3蛋白(0.56±0.06vs1.00±0.00)、twist蛋白(0.34±0.12vs1.00±0.00)、e-cadherin蛋白(0.44±0.01vs1.00±0.00)表达量明显降低,差异有统计学意义(p6组twistmrna表达增加,e-cadherinmrna表达下降,较对照组有显著性差异(1.63±0.04vs1.00±0.00,0.56±0.06vs1.00±0.00;p6+二甲双胍组twistmrna、e-cadherinmrna表达下降,较对照组有显著性差异(0.45±0.02vs1.00±0.00,0.26±0.10vs1.00±0.00;p6 VS1.00±0.00,1.05±0.34 VS 1.00±0.00;p>0.05)。结论:1、IL-6能诱导宫颈癌Hela细胞EMT;2、二甲双胍可能经JAK/STAT3信号通路抑制IL-6诱导的宫颈癌Hela细胞上皮-间质转化。

关键词：宫颈癌二甲双胍重组人白细胞介素-6 JAK/STAT3信号通路上皮-间质转化