检索结果-南通市图书馆

作者：钱娜娜吉林大学

学位级别：硕士

Ⅲ型胶原蛋白是胶原蛋白超家族的主要成员,由于其形成的纤维直径小,同时具备促进凝血及浅表伤口愈合等多种功能,因而广泛应用于医学美容和医疗器械领域。动物来源的Ⅲ型胶原蛋白存在病毒感染、免疫排斥的安全隐患以及产能不足等多方面... 详细信息

Ⅲ型胶原蛋白是胶原蛋白超家族的主要成员,由于其形成的纤维直径小,同时具备促进凝血及浅表伤口愈合等多种功能,因而广泛应用于医学美容和医疗器械领域。动物来源的Ⅲ型胶原蛋白存在病毒感染、免疫排斥的安全隐患以及产能不足等多方面的问题,因此,基因工程重组胶原蛋白现已成为关注的焦点。然而,国内现有重组Ⅲ型胶原蛋白产品都是胶原蛋白的片段或人为设计的非天然序列的类似物,不仅无法涵盖天然胶原蛋白的全部功能区,更难以达到天然胶原蛋白的结构强度。一些研究在表达时添加亲和纯化标签,虽然有利于纯化,但纯化标签的免疫原性也额外增加了安全风险。鉴于以上问题,本文构建了能够表达全序列人Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母分泌表达系统,并对纯化得到的全序列胶原蛋白进行了表征,同时构建脯氨酸羟化酶表达载体和宿主,尝试探索可实现胞内羟化修饰的共表达方案。论文的主要研究内容如下:首先,我们选择菊粉酶信号肽(INU)和酵母转化酶信号(INVE)替代α-factor引导目的蛋白的分泌。两种信号肽的编码序列通过基因合成克隆至p PICZ B中得到p PICZ-INU和p PICZ-INVE两个载体,然后将合成的人Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)基因分别连接进两个载体中,得到表达载体p PICZ-INU-COL3A1和p PICZ-INVE-COL3A1。用所得表达载体电转化毕赤酵母X33,随机挑取12个转化子进行摇瓶发酵,在发酵液上清中检测到目的条带。随后,采用质谱法进行肽段覆盖率和N/C-末端氨基酸序列测定对该条带进行鉴定,确证COL3A1在两种信号肽调控下均成功实现分泌表达,并且在p PICZ-INVE-COL3A1的转化子中筛到一株表达量较高的工程菌,将该工程菌命名为INVE-COL3A1,以此工程菌为基础开展后续实验。其次,为了探索能够实现COL3A1羟化修饰的方法,我们将p GAPZ A的筛选标记由博来霉素(Zeocin)替换为杀稻瘟菌素(Blasticidin),所得载体命名为p GAPB。用2A肽连接人脯氨酰4-羟化酶(P4H)的α亚基和β亚基,将其整体的编码基因克隆至p GAPB中,获得表达载体p GAPB-P4H并电转化上一步工作获得的INVE-COL3A1重组菌。随机挑取6个转化子摇瓶发酵,利用甘油和甲醇诱导COL3A1和P4H共表达,对摇瓶发酵上清进行SDS-PAGE检测,结果显示其中一个转化子的COL3A1表达条带比INVE-COL3A1菌株更明显,将其命名为INVE-COL3A1-P4H。随后,通过盐析和离子交换等技术,我们分离纯化了工程菌INVE-COL3A1-P4H表达的COL3A1,其电泳纯度大于80%。质谱法测定肽段覆盖率为86%,N/C端与理论序列均能完全匹配,再结合SDS-PAGE目的条带的分子量大小,我们可以确定表达产物为全序列COL3A1。羟基化分析结果表明,其脯氨酸残基的羟基化位置和丰度远低于天然胶原蛋白。但是Hacat细胞的增殖和迁移结果表明,其生物学活性与市售重组人源化Ⅲ胶原蛋白相当。最后,我们尝试对INVE-COL3A1-P4H工程菌进行高密度发酵,期望通过充足的供氧改善目的蛋白的羟化修饰,并评估工程菌的目的蛋白产量。与摇瓶发酵相比,72 h高密度发酵产物的质谱分析结果表明,COL3A1脯氨酸羟基化修饰位点及丰度未见明显提高,但是SDS-PAGE检测结果显示,本工程菌表达的目的蛋白在培养基中积累量可达2 g/L,初步满足了产业化需求。通过以上工作,我们获得了一株高表达重组人源化ⅲ型胶原蛋白的工程菌。通过发酵优化和15 L发酵罐小试提升了其表达量,探究了重组胶原蛋白的纯化方法和羟化修饰方案,为重组人Ⅲ型胶原蛋白的工业化生产奠定了基础。

关键词：重组人源化ⅲ型胶原蛋白 COL3A1 毕赤酵母分泌表达羟化修饰

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重组人源化ⅲ型胶原蛋白对皮肤功能性相关基因表达的影响

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日用化学工业（中英文） 2022年第12期52卷 1326-1332页

作者：范婷赵健烽常烨珺季乐江苏江山聚源生物技术有限公司江苏靖江214500

重组人源化ⅲ型胶原蛋白(RHCⅢ)由人胶原原始基因序列经过优化重组表达所得,与人体天然胶原氨基酸序列高度一致。为探究重组人源化ⅲ型胶原蛋白应用在化妆品中,对减缓皮肤皱纹的功效作用,通过测试其作用于人皮肤成纤维细胞和角质形成细... 详细信息

重组人源化ⅲ型胶原蛋白(RHCⅢ)由人胶原原始基因序列经过优化重组表达所得,与人体天然胶原氨基酸序列高度一致。为探究重组人源化ⅲ型胶原蛋白应用在化妆品中,对减缓皮肤皱纹的功效作用,通过测试其作用于人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞,在皮肤功能性基因层面验证其抗皱功效。结果表明,5 mg/mL RHCⅢ作用于人皮肤成纤维细胞可显著促进胶原合成相关基因CollagenⅠ,CollagenⅢ和Smad3的表达;同时,在UVA刺激条件下可显著抑制胶原降解相关基因MMP-1,MMP-3,c-jun和c-fos的表达。作用于角质形成细胞可显著促进皮肤屏障修复和保湿相关基因LOR,TGM1,IVL,OCLN1,DSG1,FLG,Caspase14和K1的表达。综上所述,样品重组人源化ⅲ型胶原蛋白在5 mg/mL的给药质量浓度下具有抗皱功效。

关键词：重组人源化ⅲ型胶原蛋白胶原合成和降解屏障修复和保湿抗皱

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调节头皮衰老的研究进展

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中国医药指南 2023年第35期21卷 44-47页

作者：吕宁刘阳子上海首尔丽格医疗美容医院上海200082

生活水平和医疗技术的提高使抗衰变得个性化、全面化,头皮抗衰就是依现代人的美容诉求应运而生,改善内容包括头皮的厚度、头发的质量和数量等。虽然头皮老化的确切机制尚不明确,但通过其组织学改变以及富血小板血浆注射、微针疗法等治... 详细信息

生活水平和医疗技术的提高使抗衰变得个性化、全面化,头皮抗衰就是依现代人的美容诉求应运而生,改善内容包括头皮的厚度、头发的质量和数量等。虽然头皮老化的确切机制尚不明确,但通过其组织学改变以及富血小板血浆注射、微针疗法等治疗脱发的生理学改变均已证实,胶原蛋白的减少或增加是老化和抗衰的重要环节。向头皮中人工导入无动物源免疫源性的重组人源化ⅲ型胶原蛋白,理论上是一项具有科学性和安全性的头皮抗衰治疗技术。

关键词：头皮衰老脱发重组人源化ⅲ型胶原蛋白

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