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乙型肝炎病毒Core蛋白通过MLX调控肝细胞脂类代谢的定量蛋白质组学研究

乙型肝炎病毒Core蛋白通过MLX调控肝细胞脂类代谢的定量蛋白质组...

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作者：樊锋旭安徽医科大学

学位级别：硕士

蛋白质组学是全景式鉴定和定量细胞或组织的蛋白质,并且系统研究蛋白质功能的新兴学科。随着液相色谱--质谱联用技术、生物信息学技术以及生物样本的化学标记方法的不断发展,蛋白质组学研究已由低覆盖鉴定转变为高覆盖鉴定,由简单的定... 详细信息

蛋白质组学是全景式鉴定和定量细胞或组织的蛋白质,并且系统研究蛋白质功能的新兴学科。随着液相色谱--质谱联用技术、生物信息学技术以及生物样本的化学标记方法的不断发展,蛋白质组学研究已由低覆盖鉴定转变为高覆盖鉴定,由简单的定性鉴定研究转变为高精度定量研究已成为蛋白质组学研究的大趋势。由于实验误差的存在,基于无标定量(LFQ, Label Free Quantitation)和基于肽段层面的化学标记定量(iTRAQ, isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)在定量精度和灵敏度上都难于与基于稳定同位素标记氨基酸的细胞培养定量蛋白质组技术(SILAC, Stable Isotope Labeling with Amino acids in cell Culture)相媲美。正如德国科学家Mann总结的,SILAC已经成为蛋白质组学定量的金标准。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)引起的乙型肝炎是我国第一大传染疾病。其中,由HBV感染导致患者发生肝炎、肝硬化和肝癌是感染后疾病发生、发展的三个病程。HBV病毒编码病毒的核心蛋白(HBc, Core protein)在宿主细胞内组装形成病毒核心颗粒,并包裹病毒的半不闭合环状DNA。核心颗粒能够协调成熟的HBV病毒基因组DNA转移到宿主细胞的细胞核中,导致HBV能够持续的感染肝细胞,但目前科学家对HBc蛋白在肝病发生、发展中的功能和作用机制尚不清楚。本研究通过向肝癌细胞系HepG2细胞转染p3×Flag CMV14/HBc质粒,然后使用G418筛选,成功构建了能稳定表达HBc蛋白的多克隆细胞系和对照组细胞系。我们首先对筛选出的稳转细胞系进行了一系列的细胞表型实验研究。通过油红O染色实验发现HepG2细胞表达HBc蛋白后,细胞内脂质发生明显蓄积。CCK-8细胞增殖活性实验则表明HBc蛋白存在着促进细胞增殖的功能。细胞划痕实验证实HBc稳转细胞系的迁移能力较对照组明显提高。HBc细胞的游离胆固醇与对照组没有差异,但是总胆固醇明显升高,提示HBc细胞内的胆固醇酯类含量比对照组有所升高。本研究利用高覆盖、高精度正反SILAC标记策略,系统地揭示了HBc引起细胞内蛋白质丰度变化的规律。将这些定量差异蛋白进行GO (Gene Oncology)分析和功能注释,发现其在胆固醇、脂质合成与蓄积、糖酵解方面显著富集,表明HBc通过引发肝细胞脂肪化促进肝病发展的分子机制。进一步利用CoIP-LC-MS/MS技术,我们成功地鉴定到了与HBc结合的关键转录调控因子MLX。利用ChIP-qPCR技术,我们证实MLX可结合到这些参与能量代谢的差异蛋白编码基因上游调控序列。利用荧光标记和显微技术,我们发现HBc蛋白通过与MLX结合,裹挟MLX蛋白入核,从而增强代谢相关差异蛋白的转录水平,并导致肝细胞发生脂质蓄积的分子机制。

关键词：重稳定同位素代谢标记乙型肝炎病毒Core蛋白 MLX 染色质免疫共沉淀

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