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新乡医学院学报 2024年第3期41卷 214-220页

作者：王素娟田晓平赵巧辉王天云郑州伊美诺生物技术有限公司河南郑州450016 新乡医学院河南新乡453003

目的利用噬菌体展示技术及重组抗体构建技术筛选出特异性醛固酮(ALD)抗体,为ALD诊断试剂盒的研发提供原材料。方法取5只健康清洁级新西兰大白兔,将抗原ALD-血蓝蛋白(KLH)稀释至2 mg·L^(-1),采用背部多点注射方法对5只新西兰大白兔进行... 详细信息

目的利用噬菌体展示技术及重组抗体构建技术筛选出特异性醛固酮(ALD)抗体,为ALD诊断试剂盒的研发提供原材料。方法取5只健康清洁级新西兰大白兔,将抗原ALD-血蓝蛋白(KLH)稀释至2 mg·L^(-1),采用背部多点注射方法对5只新西兰大白兔进行首次免疫,免疫剂量为每只1 mg;每隔2周进行1次免疫,且免疫剂量减少50%;从第3次免疫开始,每次免疫1周后采集大白兔耳缘静脉血,使用包被0.25 mg·L^(-1) ALD-BSA抗原的化学发光板,采用间接法和竞争法测定血清滴度;第5次免疫后选取血清效价高、特异性好的大白兔,取其脾脏和骨髓等组织。将脾脏组织研磨,采用TRIzol试剂一步法提取RNA,获取轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因序列。通过连接肽连接成单链片段(ScFv)并构建至噬菌粒载体Pcomb3xss中;然后,通过电转化方法将其导入大肠杆菌TG1,完成ALD ScFv噬菌体展示库构建。对文库进行3~5轮富集筛选,并挑取单克隆进行噬菌体上清制备,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)竞争法鉴定后送测,获得高竞争性克隆序列;将筛选得到的克隆序列插入至pCMV3表达载体,提取质粒后使用瞬时转染方法进行HEK293细胞转染;1周后,收取上清,应用亲和层析纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳鉴定其纯度及表达量。结果5只大白兔在第5次免疫后,间接法检测其血清效价结果显示,4#、5#大白兔血清在稀释32000倍后,效价仍>10000。竞争法检测结果显示,5#大白兔血浆样本低值与高值的比值为2:1,优于其他大白兔。选取5#大白兔进行噬菌体文库构建。使用常规聚合酶链反应扩增出VL及VH基因片段,经搭桥拼接成ScFv(VL+VH)后,琼脂凝胶电泳分析可看到750 bp左右大小条带,与最初设计的片段大小一致。ScFv经酶切连接电转至大肠杆菌TG1中,构建一个库容为4.73×10^(8) cfu·mL^(-1)的噬菌体文库。经3轮淘洗出库平皿挑取300个单克隆,制备单克隆噬菌体,ELISA结果显示,300个克隆中阳性率达100%,校准品竞争检测阳性克隆42个,筛出率14%;42个阳性克隆进一步进行临床样本竞争检测,筛出16株单克隆符合要求,将16株进行复测,2次检测结果一致;测序后优选6条抗体序列进行构建表达,纯化后SDS-PAGE还原胶电泳结果显示,在重链50000及轻链25000位置均有条带,获得6株高亲和力、竞争性的兔ALD单抗。结论通过噬菌体展示技术成功筛选出6株高亲和力、竞争性的兔ALD抗体,这为小分子抗体的发现提供了一种参考方法。筛选出的AD185、AD277抗体在校准品及临床样本竞争中,均表现出比阳性对照高出2倍的竞争优势,这为ALD检测试剂盒原材料的开发提供了可能性。

关键词：噬菌体展示醛固酮抗体蛋白A亲和纯化

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