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耐高温酸性脂肪酶产生菌的选育及其酶学特性研究

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耐高温酸性脂肪酶产生菌的选育及其酶学特性研究

作者：张开平河南工业大学

学位级别：硕士

从富含油脂的土壤中筛选到一株产耐高温酸性脂肪酶菌株B-36。对该菌进行了菌种鉴定、诱变选育、发酵条件优化、酶分离纯化及其酶学性质以及生产生物柴油研究。(1)产耐高温酸性脂肪酶菌株的分离筛选：从郑州西郊不同地点采集含油的土样5... 详细信息

从富含油脂的土壤中筛选到一株产耐高温酸性脂肪酶菌株B-36。对该菌进行了菌种鉴定、诱变选育、发酵条件优化、酶分离纯化及其酶学性质以及生产生物柴油研究。(1)产耐高温酸性脂肪酶菌株的分离筛选：从郑州西郊不同地点采集含油的土样50份。用溴甲酚紫平板筛选法分离到48株产脂肪酶菌株;对酶活力在9.0-9.6U/mL的16株菌进行酸性三丁酸甘油酯平板鉴定,得到一株产酶能力较强的菌株B-36。(2)菌株B-36分类鉴定：对菌株进行形态学、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析,确定该菌为克雷伯氏菌,命名为Klebsiella sp.B-36。(3)诱变选育：以Klebsiella sp.B-36菌株为出发菌株,经第一阶段8轮紫外线(UV)50s剂量诱变;第二阶段5轮微波25s剂量诱变;第三阶段8轮硫酸二乙酯(DES)15min剂量诱变后,选育得到一株稳定性好、酶活力较高的突变株DES-5,酶活力比原始菌株提高了77.5%。(4)产酶条件研究：通过单因素试验和正交设计L9(33)对Klebsiella sp.B-36菌株进行发酵培养基优化。研究表明,发酵培养基最优组合(%)：酵母膏0.8,蛋白胨3,橄榄油0.8;通过单因素试验和响应面设计对Klebsiella sp.B-36菌株进行发酵条件优化,得到最佳发酵条件为：pH4.85,温度46.5℃,装液量60mL/250mL,接种量2.12%,酶活力提高到21.79U/mL.(5)脂肪酶的分离纯化：发酵液离心,上清液分别经70%硫酸铵沉淀、透析除盐、Sephadex G-75层析等纯化后,用SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质纯度,得到电泳图谱为单一条带,分子量为27.19KDa,说明纯化得到较纯的蛋白质样品。脂肪酶纯化后比活力达到367.42U/mg.纯化倍数为10.29倍、回收率为26.45%。脂肪酶酶学性质研究表明：最适作用温度60℃、pH4.0,具有良好的热稳定性以及在酸性条件下稳定性较好。Mg2+、Ca2+、Na+对酶有明显的激活作用,Fe3+、Cu2+及Zn2+对酶有抑制作用,初步判定该酶是金属离子依赖酶。(6)对固定化脂肪酶Klebsiella sp.B-36催化生产生物柴油的工艺进行了研究。研究表明脂肪酶Klebsiella sp. B-36可以催化合成生物柴油。通过单因素试验,确定了酶法合成生物柴油的最佳工艺条件：固定化脂肪酶用量3g,反应温度40℃,反应时间24h,醇油摩尔比9：1(每隔8h加1/3甲醇总量,分3次流加),转化率最高可达到31.65%。总之,本文报道了克雷伯氏菌可以产耐高温酸性脂肪酶,并对其进行人工诱变、发酵条件优化、酶的分离纯化、酶学性质研究,酶法合成生物柴油的初步探索,具有较大的开发应用潜力。一系列基础研究为菌种改良和产脂肪酶的高效基因工程菌的构建奠定了基础。

关键词：克雷伯氏菌酸性脂肪酶分离鉴定诱变选育发酵优化分离纯化生物柴油

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一株酸性脂肪酶高产菌株的筛选与鉴定

食品安全质量检测学报 2017年第12期8卷 4509-4515页

作者：王乐刘松尹艳丽黄巍吕扬勇胡元森惠明王金水河南工业大学生物工程学院郑州450001

目的分离筛选出一株酸性脂肪酶高产菌株并对其进行鉴定。方法通过溴甲酚紫酸碱指示剂进行平板初筛,甘油三丁酸酯透明圈法以及摇瓶培养复筛,筛选获得了一株酸性脂肪酶产生菌株;利用平板透明圈法、橄榄油乳化液滴定法和对硝基苯酚比色法3... 详细信息

目的分离筛选出一株酸性脂肪酶高产菌株并对其进行鉴定。方法通过溴甲酚紫酸碱指示剂进行平板初筛,甘油三丁酸酯透明圈法以及摇瓶培养复筛,筛选获得了一株酸性脂肪酶产生菌株;利用平板透明圈法、橄榄油乳化液滴定法和对硝基苯酚比色法3种方法对所筛菌株进行酶活力测定。结果分离获得一株具有高产酸性脂肪酶活力的菌株,将其命名为菌株WY19。经过检测,其粗酶活力达到11000 U/L。通过对菌株WY19进行形态学鉴定、生理生化实验以及分子生物学鉴定,结合系统发育树分析,确定本研究获得的酸性脂肪酶产生菌为克雷伯氏菌。结论菌株WY19所产脂肪酶为酸性脂肪酶,在食品、医药、油脂加工等领域方面具有较好的应用前景。

关键词：酸性脂肪酶活力测定筛选鉴定克雷伯氏菌

产耐高温酸性脂肪酶菌株A-16的诱变选育及其发酵条件优化

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生物过程 2015年第2期5卷 15-24页

作者：张开平刘燕丽马博黄娇丽潘月楼欧阳秋飞百色学院农业与食品工程学院广西百色

从炼油厂附近土壤中筛选得到一株产耐高温酸性脂肪酶菌株A-16,通过紫外线(UV)和甲基磺酸乙酯(EMS)的复合诱变选育,获得1株产脂肪酶活力较高的突变株UE-03,产脂肪酶活力为17695.6 U/mL,比原始菌株提高了73.6%,将UE-03连续传代培养5次,产... 详细信息

从炼油厂附近土壤中筛选得到一株产耐高温酸性脂肪酶菌株A-16,通过紫外线(UV)和甲基磺酸乙酯(EMS)的复合诱变选育,获得1株产脂肪酶活力较高的突变株UE-03,产脂肪酶活力为17695.6 U/mL,比原始菌株提高了73.6%,将UE-03连续传代培养5次,产酶能力稳定。对突变株UE-03产酶条件进行了探讨,通过单因素试验筛选出最适初始pH4.0,温度为45℃,吐温-80添加量为0.15% w/v;在此基础上采用响应面分析法优化产酶条件,得到适宜产酶条件为:pH 4.28,温度46.8℃,吐温-80添加量0.15% w/v,经优化后菌株产酶活力达到19339.5 U/mL,为该菌株进一步开发利用提供优良菌种和技术参考。

关键词：酸性脂肪酶诱变选育遗传稳定性发酵条件响应面分析

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一株柱状假丝酵母产脂肪酶条件的优化研究

中国油脂 2015年第5期40卷 70-75页

作者：徐启峻滕宏飞黄程赵玉谨罗红宇浙江海洋学院食品与药学学院浙江舟山316004

对一株柱状假丝酵母菌的产酶条件进行了优化。确定最佳培养基配方为橄榄油6 g/L、酵母膏9 g/L、吐温-80 1%、Ca Cl20.5 g/L、K2HPO42 g/L、Mg SO4·7H2O 2 g/L、p H自然;确定最优发酵条件为培养基初始p H 5.2、培养时间25 h、摇床转速15... 详细信息

对一株柱状假丝酵母菌的产酶条件进行了优化。确定最佳培养基配方为橄榄油6 g/L、酵母膏9 g/L、吐温-80 1%、Ca Cl20.5 g/L、K2HPO42 g/L、Mg SO4·7H2O 2 g/L、p H自然;确定最优发酵条件为培养基初始p H 5.2、培养时间25 h、摇床转速150 r/min。在最适产酶条件下,重复发酵5批后柱状假丝酵母所产脂肪酶平均酶活在(15.00±0.05)U/m L,RSD为2.34%,重复性较好。该株酵母菌生存环境为酸性,并在p H为5.2时产酶效果最好,推导该脂肪酶为酸性脂肪酶,对油脂水解产生的游离脂肪酸将会有一定程度的抵抗作用。此外,柱状假丝酵母培养25 h后即可获得最佳产酶效果,发酵周期短,既能节约成本,又能提高单位时间产酶量,适用于工业化生产。

关键词：柱状假丝酵母酸性脂肪酶生长产酶

南京板鸭生产过程中脂肪酶和磷脂酶的活力变化研究

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食品科学 2007年第11期28卷 302-305页

作者：徐为民徐幸莲周光宏郑安俭王道营南京农业大学农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室江苏南京210095 江苏省农业科学院农产品加工研究所江苏南京210014

研究了板鸭生产过程中各工艺点样品肌肉中酸性脂肪酶、中性脂肪酶和磷脂酶活力的变化趋势。结果显示,板鸭在腌制过程中,这三种酶呈逐渐上升的趋势,而在排坯和风干过程中,酶活性逐渐丧失。通过相关分析表明,板鸭加工过程中,盐含量及水分... 详细信息

研究了板鸭生产过程中各工艺点样品肌肉中酸性脂肪酶、中性脂肪酶和磷脂酶活力的变化趋势。结果显示,板鸭在腌制过程中,这三种酶呈逐渐上升的趋势,而在排坯和风干过程中,酶活性逐渐丧失。通过相关分析表明,板鸭加工过程中,盐含量及水分含量与这三种酶活性之间具有显著的相关性。

关键词：板鸭酸性脂肪酶中性脂肪酶磷脂酶

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热处理对猪肉中酸性脂肪酶活性的影响

肉类工业 2016年第7期 45-48页

作者：刘芝君黄业传马志鹏西南科技大学生命科学与工程学院四川绵阳621010

为研究热处理对猪肉中酸性脂肪酶活性的影响,以猪背最长肌为材料,研究不同温度（40~80℃）对酶活性的影响,并探究不同温度下酶的失活常数及酶的活化能。结果表明热处理时间为5min时,酸性脂肪酶的失活温度为70℃左右;在测定的酶失活温度... 详细信息

为研究热处理对猪肉中酸性脂肪酶活性的影响,以猪背最长肌为材料,研究不同温度（40~80℃）对酶活性的影响,并探究不同温度下酶的失活常数及酶的活化能。结果表明热处理时间为5min时,酸性脂肪酶的失活温度为70℃左右;在测定的酶失活温度区间内,热处理温度越高,酶失活所需的时间越短,失活速率常数越大。在热处理温度分别为40、50、60、70、80℃时,酶的失活常数分别为：0.073、0.1166、0.2189、0.7974、2.052（min-1）;酸性脂肪酶的活化能为78.444k J/mol。

关键词：背最长肌酸性脂肪酶热处理失活常数活化能

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专利技术

中国皮革 2020年第10期49卷 74-75页

专利名称:一种复合生物脱脂剂及其应用专利公开号:CN111592941A申请人:上海金狮化工有限公司;四川达威科技股份有限公司。摘要:本发明提供了-种复合生物脱脂剂及其应用,涉及皮革脱脂技术领域。本发明的复合生物脱脂剂包括如下质量份的组... 详细信息

专利名称:一种复合生物脱脂剂及其应用专利公开号:CN111592941A申请人:上海金狮化工有限公司;四川达威科技股份有限公司。摘要:本发明提供了-种复合生物脱脂剂及其应用,涉及皮革脱脂技术领域。本发明的复合生物脱脂剂包括如下质量份的组分:酸性脂肪酶15~35份;表面活性剂10~25份。本发明的复合生物脱脂剂以酸性脂肪酶为主,能够利用酸性脂肪酶在酸性条件下降解油脂的作用和表面活性剂的乳化作用,在对酸皮和蓝湿革进行补充脱脂处理时发挥生物法和化学法脱脂的协同作用,达到在酸性条件下高效脱脂的目的,从而使酸皮或蓝湿革等皮坯满足后续制革加工的要求。

关键词：脱脂剂蓝湿革酸皮酸性脂肪酶脱脂处理乳化作用表面活性剂皮革脱脂