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蓝圆鲹酸/碱等电点沉淀法分离蛋白凝胶特性与消化特性研究

蓝圆鲹酸/碱等电点沉淀法分离蛋白凝胶特性与消化特性研究

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中国食品科学技术学会第十五届年会

作者：林怡晨刘伟峰孙乐常集美大学食品与生物工程学院水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心福建省海洋功能食品工程技术研究中心

采用酸/碱溶解-等电点沉淀法（isoelectric solubilization/precipitation,ISP）制备蓝圆鲹肌肉分离蛋白（acid/alkaline aided protein isolate,API/KPI）,并对全肉蛋白（total protein,TP）、肌原纤维蛋白（myofibrillar protein,MP）与分离蛋白的理化特性、凝胶特性以及消化稳定性进行比较研究。结果表明,蓝圆鲹肌肉蛋白在碱性条件下溶解性显著高于酸性条件,经优化后的API与KPI的回收率分别为65.0%与84.6%,显著高于传统漂洗蛋白得率。一般成分与SDS-PAGE结果显示,分离蛋白的脂肪与灰分含量明显低于全肉蛋白组,蛋白组成上与TP相似,氨基酸组成中脯氨酸含量显著则低于全肉蛋白。质构与流变学结果显示,TP、MP与KPI在50-55℃会发生明显的凝胶劣化现象,60℃以上则呈现出凝胶化趋势,而API无明显变化。API与KPI的消化性显著优于TP,并与MP相近。本研究阐明了蓝圆鲹肌肉酸、碱分离蛋白的理化特性与消化性,可为蓝圆鲹的精深加工提供参考。

关键词：蓝圆鲹酸/碱溶解-等电点沉淀法理化特性凝胶特性消化性

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蓝圆鲹ISP分离蛋白凝胶劣化内在机理及应用研究

蓝圆鲹ISP分离蛋白凝胶劣化内在机理及应用研究

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作者：林怡晨集美大学

学位级别：硕士

以福建大宗低值鱼类蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)为对象,采用酸/碱溶解-等电点沉淀法(isoelectric solubilization/precipitation,ISP)制备蓝圆鲹肌肉分离蛋白(acid/alkaline-aided protein isolate,API/KPI),并对其凝胶劣化机理进行研究。结果表明,经条件优化后API与KPI的回收率分别为65.0%与84.6%,显著高于传统漂洗蛋白(得率:54.0%,主要蛋白为:肌原纤维蛋白myofibrillar proteins,MP),且分离蛋白的脂肪与灰分含量明显低于全肉蛋白(total protein,TP)。质构与流变学结果显示,TP、MP与KPI在50-55?C会发生明显的凝胶劣化现象,60?C以上则呈现出凝胶化趋势,而API无明显变化。将TP、API、KPI在50?C孵育,并观察其自身降解情况,结果显示,TP和KPI组的肌球蛋白与原肌球蛋白的自身降解最强烈。TCA可溶性肽分析上清中的蛋白酶活性,发现KPI中保留了TP大部分的酶活力,其最适pH与温度分别为pH 9.0与60?C。抑制剂结果显示,TP和KPI上清中的蛋白酶都能被丝氨酸蛋白酶抑制剂强烈抑制,暗示其中含有丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶。基于以上结果,通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose等一系列柱层析从KPI中分离纯化出一种水溶性丝氨酸蛋白酶。SDS-PAGE和肌原纤维酶谱结果显示该酶的分子量约为70kDa左右。荧光底物分析结果显示该酶能特异的水解丝氨酸家族的底物Boc-Leu-Gly-Arg-MCA。利用荧光底物测得其最适温度与最适pH分别为50?C与pH 9.0。抑制剂实验表明该酶能被丝氨酸蛋白酶类型抑制剂强烈抑制,且部分地被胃蛋白酶及组织蛋白酶抑制剂所抑制。此外,金属螯合剂EDTA对酶活有部分抑制作用,推测可能是由于其活性中心的金属离子被螯合所致。以上结果表明,该酶属于丝氨酸蛋白酶,且很有可能与蓝圆鲹碱性分离蛋白的凝胶劣化现象有关。为了阐明分离蛋白的凝胶形成机制,提取蓝圆鲹肌肉中的肌球蛋白对其进行酸(AM)/碱(KM)pH调节,并研究其理化、构象以及凝胶特性相对于天然肌球蛋白(NM)的变化。AM在40?C孵育后溶解度最低而浊度最高,表明经过酸处理的肌球蛋白容易发生变性和聚集。圆二色谱结果显示酸碱处理会使肌球蛋白的二级结构发生变化,当pH调回中性时,KM相对AM更接近于天然状态。流变学分析结果表明,AM在加热过程中储能模量没有发生显著性变化,表明酸处理使其肌球蛋白构象发生不可逆的变化,引起强烈的变性和聚集现象,最终导致了凝胶能力丧失。这一结果也侧面说明碱法制备蓝圆鲹分离蛋白相对更为可行。为了实现在蓝圆鲹碱分离蛋白的工业化应用,添加了不同比例的大豆分离蛋白抑制其内源性蛋白酶的活力避免凝胶劣化。结果发现,1%的大豆分离蛋白可有效抑制内源性蛋白酶对肌球蛋白重链的降解,且提高鱼糜的凝胶强度。后续在碱分离蛋白添加葡萄糖酸内酯(glucono-δ-lactone,GDL)和谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG),制备出一款水分含量高,凝胶强度低适合咀嚼吞咽困难的人群食用的软凝胶鱼糜制品。结果表明2%GDL和1%TG的添加均能促使其发生凝胶化,其中GDL凝胶强度要高于TG组,呈现出更高的硬度,白度以及更为致密的凝胶网络结构。化学键和SDS-PAGE结果表明,GDL能够提高蛋白的疏水性并且促进二硫键的形成,而TG能够促进肌球蛋白的交联,形成大分子聚合物,从而促进蛋白凝胶的形成。

关键词：蓝圆鲹酸/碱溶解-等电点沉淀法凝胶劣化丝氨酸蛋白酶肌球蛋白

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