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金顶侧耳蛋白及酶解肽—亚铁螯合物的制备与特性研究

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金顶侧耳蛋白及酶解肽—亚铁螯合物的制备与特性研究

作者：王莹南京农业大学

学位级别：硕士

金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)色艳味鲜,营养丰富,具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化等生物活性,是一种典型的食药两用型真菌。目前,针对金顶侧耳的研究主要集中在金顶侧耳多糖及其栽培上,而对于金顶侧耳蛋白的研究较少。铁是... 详细信息

金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)色艳味鲜,营养丰富,具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化等生物活性,是一种典型的食药两用型真菌。目前,针对金顶侧耳的研究主要集中在金顶侧耳多糖及其栽培上,而对于金顶侧耳蛋白的研究较少。铁是人体所必需的微量元素,机体缺铁会引发贫血、免疫力低下等多种疾病。传统铁强化剂储存稳定性和生物利用度有限,而通过酶解蛋白获得的多肽与亚铁离子的螯合物可以克服这一缺点。本文采用超声辅助碱提酸沉法提取金顶侧耳蛋白,并对比研究了超声碱提蛋白与常规碱提蛋白的结构特性与加工特性,接着采用酶解法制备金顶侧耳蛋白多肽,利用超滤与Sephadex G-25凝胶层析对其进一步纯化,将纯化后的多肽与亚铁离子螯合制备肽铁螯合物,并通过紫外扫描、红外扫描、电镜扫描探究其基本表征,最后通过体外模拟消化探究其消化的稳定性。以金顶侧耳蛋白提取率为考察指标,进行单因素实验和响应面设计试验,最终结合实验实际情况确定超声辅助提取金顶侧耳蛋白的最佳工艺为Na OH浓度0.075mol/L、液料比43:1、超声时间39 min、超声输入功率350 W(实测声能密度为46.20W/L),此条件下所得金顶侧耳蛋白提取率为30.50%。接着进行金顶侧耳蛋白特性的研究,结果表明:金顶侧耳蛋白的分子量主要分布范围在5～15 k Da、30～35 k Da、35～50 k Da区间内以及65 k Da和95 k Da左右,超声辅助提取不会引起蛋白分子量的变化;金顶侧耳蛋白氨基酸含量较为丰富,超声碱提蛋白与常规碱提蛋白中必需氨基酸分别占总氨基酸含量的41.67%、41.82%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为0.7127、0.7187,属于理想蛋白质;红外扫描分析发现超声碱提蛋白与常规碱提蛋白出峰情况大致相同,但有少数特征峰发生了变化。扫描电镜分析发现超声碱提蛋白显示出更多的不规则碎片和无序结构,表面较为粗糙;而常规碱提蛋白组织结构紧密,表面较为光滑。超声辅助提取使得金顶侧耳蛋白具有更高的二硫键含量,更强的疏水性和持水性;碱性条件下超声辅助提取的金顶侧耳蛋白具有更好的溶解性、起泡性及乳化性。采用酶解法水解金顶侧耳蛋白以制备金顶侧耳多肽,经初步筛选确定碱性蛋白酶为最佳蛋白酶,接着以蛋白水解度和肽铁螯合率为考察指标,通过单因素试验与正交试验确定金顶侧耳蛋白最佳酶解条件为底物浓度3%、酶浓度为6000 U/g、p H 9.0、温度55℃,酶解时间3 h,此条件下蛋白水解度为22.94%,肽铁螯合率为41.82%。将酶解得到的多肽经超滤分为PCPPI:10 k Da三个组分,发现分子量较小的PCPPI肽铁螯合率最高,可达到51.21%;继续利用Sephadex G-25凝胶层析纯化,得到两个组分PCPPI-1、PCPPII-2,其中PCPPII-2的肽铁螯合率较高,可达到60.07%。将纯化后的多肽PCPPI-1、PCPPII-2与Fe SO4·7H2O按照3:1的比例在p H 6.5、温度35℃的条件下螯合30 min,得到肽铁螯合物PCPPI-1-Fe、PCPPI-2-Fe,并对其进行结构表征。通过氨基酸分析发现多肽中的Asp、Glu、Lys与Arg在肽铁螯合过程中发挥主要作用,通过紫外光谱发现多肽与亚铁离子螯合后产生了新的物质,通过红外光谱发现多肽与亚铁离子的螯合反应主要与肽中的羧基氧与氨基氮有关,通过电镜扫描发现铁离子可以诱导多肽中小颗粒的聚集,导致多肽结构的破坏和较大球形颗粒的形成。最后通过体外模拟消化实验证明了PCPPI-1-Fe、PCPPI-2-Fe比硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁具有更好的消化稳定性。

关键词：金顶侧耳蛋白超声辅助提取酶解肽肽铁螯合物

罗非鱼酶解肽抑制冷藏鱼糜中油脂和蛋白质氧化能力

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食品科学 2016年第5期37卷 89-93页

作者：郭利平荣婧杨宁郭善广广东轻工职业技术学院轻化工程系广东广州510300 华南农业大学食品学院广东广州510642 广东省对外科技交流中心广东广州510033

将罗非鱼的酶解产物及其超滤组分（〈5 k D酶解肽）加入罗非鱼鱼糜制品中,研究其在冷藏（0~4℃）期间对油脂和蛋白质的抗氧化效果。结果表明：酶解产物及超滤组分均可以改善鱼糜的色泽（P〈0.05）,尤其是超滤组分的效果接近于一定剂量的... 详细信息

将罗非鱼的酶解产物及其超滤组分（〈5 k D酶解肽）加入罗非鱼鱼糜制品中,研究其在冷藏（0~4℃）期间对油脂和蛋白质的抗氧化效果。结果表明：酶解产物及超滤组分均可以改善鱼糜的色泽（P〈0.05）,尤其是超滤组分的效果接近于一定剂量的VC;酶解产物对鱼糜中的油脂、蛋白质均表现出较强的抗氧化能力（P〈0.05）,其中超滤组分优于酶解液;酶解肽可以有效地保持鱼糜在冷藏期间的品质,超滤分离富集的〈5 k D的小分子肽显示出更好的抗氧化效果。

关键词：鱼糜酶解肽蛋白质氧化超滤抗氧化活性

酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆幼鱼生长性能、体营养成分、消化及生理代谢指标的影响

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饲料工业 2020年第18期41卷 59-64页

作者：张宇高佳朋韩和平夏辉李雪鹤荆冰妍吴彦郭冉河北农业大学海洋学院河北秦皇岛066003 河北省秦皇岛广播电视大学河北秦皇岛066000 河北省海洋生物资源与环境重点实验室河北秦皇岛066003

试验旨在研究酶解肽部分替代鱼粉后加入胆汁酸对大菱鲆(12.15±0.03)g生长性能及消化代谢的影响。试验设计了五组等氮等能饲料,鱼粉组为对照组D0,试验组等比例替代鱼粉,分别为7%肽组D1、14%肽组D2、7%肽加胆汁酸组D3、14%肽加胆汁酸组D... 详细信息

试验旨在研究酶解肽部分替代鱼粉后加入胆汁酸对大菱鲆(12.15±0.03)g生长性能及消化代谢的影响。试验设计了五组等氮等能饲料,鱼粉组为对照组D0,试验组等比例替代鱼粉,分别为7%肽组D1、14%肽组D2、7%肽加胆汁酸组D3、14%肽加胆汁酸组D4。每组三个重复,每重复30尾鱼,试验期56 d。结果表明:各试验组增重率、饲料系数、成活率、肝体比与D0组相比无显著差异(P>0.05)。D1、D3组背肌粗蛋白含量显著高于其他各组(P0.05);血浆中葡萄糖含量D3、D4组显著低于其他各组。全鱼背肌粗脂肪和蛋白酶含量为D3、D4组分别显著高于D1、D2组(P0.05),但D3组高于D1组(P>0.05),D4组显著高于D2组(P酶解肽替代部分鱼粉后补充胆汁酸对大菱鲆生长性能、脂肪累积及消化代谢有一定的促进作用。

关键词：酶解肽胆汁酸大菱鲆生长性能消化代谢

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细点圆趾蟹肉酶解肽螯合锌工艺的优化

核农学报 2016年第9期30卷 1786-1791页

作者：胡小超周果高喜乐杨文鸽楼乔明徐大伦温建丰徐军方宁波大学海洋学院/浙江海洋高效健康养殖协同创新中心浙江宁波315211

为了优化蟹肉酶解肽的锌螯合工艺,以细点圆趾蟹肉为原料,制得蟹肉酶解物,通过单因素试验,考察酶解物与硫酸锌的质量比、pH、反应时间、酶解物浓度、反应温度对锌修饰蟹肉酶解肽的影响,采用正交试验优化蟹肉酶解肽的锌修饰工艺。结果表明... 详细信息

为了优化蟹肉酶解肽的锌螯合工艺,以细点圆趾蟹肉为原料,制得蟹肉酶解物,通过单因素试验,考察酶解物与硫酸锌的质量比、pH、反应时间、酶解物浓度、反应温度对锌修饰蟹肉酶解肽的影响,采用正交试验优化蟹肉酶解肽的锌修饰工艺。结果表明,在酶解物与硫酸锌的质量比2∶1、pH值6.5、时间60 min、酶解物浓度5%、温度55℃条件下,酶解肽-锌的螯合率为91.52%,螯合物得率为25.83%,该工艺条件下酶解肽与锌的螯合率和螯合物得率均较高。本研究结果为新型生物态锌的研制、细点圆趾蟹的高值化利用提供了依据。

关键词：细点圆趾蟹酶解肽锌修饰

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酶解肽在大菱鲆配合饲料中的应用研究

酶解肽在大菱鲆配合饲料中的应用研究

作者：张宇河北农业大学

学位级别：硕士

为了研究酶解肽替代大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）配合饲料中部分鱼粉的可行性和最佳替代量,本试验通过不同比例的酶解肽替代鱼粉确定适宜替代量、分子量不同的肽替代鱼粉、酶解肽替代部分鱼粉后加入胆汁酸对大菱鲆的影响三部分试... 详细信息

为了研究酶解肽替代大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）配合饲料中部分鱼粉的可行性和最佳替代量,本试验通过不同比例的酶解肽替代鱼粉确定适宜替代量、分子量不同的肽替代鱼粉、酶解肽替代部分鱼粉后加入胆汁酸对大菱鲆的影响三部分试验来分析酶解肽在大菱鲆中的应用研究。试验一:本试验旨在研究酶解肽替代鱼粉对大菱鲆生长性能、消化代谢、免疫指标、肝脏蛋白质组学和肠道菌群的影响。选取初始体重（10.32±0.26）g,大小均匀,体质健壮的大菱鲆450尾为研究对象进行试验,随机分为5组,每组3个重复,每个重复30尾鱼。5组试验分别替代0（对照）、8%、16%、24%和32%鱼粉的5种等氮等能饲料,分别记为D0、D8、D16、D24、D32。试验期为56d。试验结果表明:酶解肽替代鱼粉水平为8%和16%时,大菱鲆的增重率、成活率、特定生长率、饲料系数、肝体比、肥满度、脏体比等生长指标均无显著影响（P＞0.05）。酶解肽替代鱼粉水平超过8%时,全鱼粗脂肪、背部肌肉粗脂肪含量显著低于对照组（P＜0.05）。D0、D8组肝脏中总抗氧化能力、胃蛋白酶、胰蛋白酶活性显著高于D24、D32组（P＜0.05）,D0、D8组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性和丙二醛含量显著低于D24、D32组（P＜0.05）。D0、D8组血浆中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、补体C3、补体C4活性和尿素氮、丙二醛含量显著低于D24、D32组（P＜0.05）,D0、D8组的总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性、总蛋白、甘油三酯、总胆固醇、葡萄糖含量显著高于D24、D32组（P＜0.05）。各组粗蛋白质的表观消化率、粗脂肪表观消化率、干物质表观消化率呈现先升高后降低的趋势。由此可见,在本试验条件下,以生长性能为基础,综合考虑消化、代谢、特异性免疫等指标,酶解肽替代大菱鲆饲料中鱼粉的适宜水平为8%。试验二:本试验旨在研究不同分子量的酶解肽部分替代鱼粉后对大菱鲆（12.15±0.03g）生长性能、消化代谢及免疫指标的影响。试验设计了四组等氮等能饲料,鱼粉组为对照组A0,试验组分别为14%1000以下肽组A1、14%1000以上肽组A2、14%全肽组A3。每组三个重复,每个重复30尾鱼,试验进行56d。结果显示:各组增重率、特定生长率、肝体比、肥满度无显著性差异（P＞0.05）,饲料系数、脏体比A1、A2组显著高于对照组（P＜0.05）。全鱼粗灰分和背肌粗脂肪显著低于对照组（P＜0.05）。血浆中葡萄糖、胆固醇、甘油三酯含量全肽组显著高于其他各组（P＜0.05）,尿素氮含量试验组显著高于对照组且A3组显著低于A1、A2组（P＜0.05）。肝脏中脂肪酶含量A2组显著低于A0组（P＜0.05）。血浆中谷草转氨酶含量A2组显著高于其他组,谷丙转氨酶A2组显著低于其他组,肝脏中谷草转氨酶含量A1组显著高于A0组,各试验组谷丙转氨酶含量显著高于对照组。血浆中HICN、CAT、AKP、SOD、T-AOC活性显著低于对照组且A3组HICN、CAT、SOD活性显著高于A1、A2组（P＜0.05）,A3组AKP、LZM活性与A2组无显著性差异（P＞0.05）且显著高于A1组（P＜0.05）,各组血浆中MDA含量呈先升高后下降的趋势且A3组与A0组无显著性差异（P＞0.05）,肝脏中T-AOC活性A3组显著高于其他各组（P＜0.05）。综上所述,在本试验条件下,以生长性能为基础,综合考虑消化、代谢、免疫等指标,分子量不同的小肽和多肽对于高比例酶解肽替代大菱鲆饲料中鱼粉对鱼体的影响并无明显改善作用。试验三:本试验旨在研究酶解肽部分替代鱼粉后加入胆汁酸对大菱鲆（12.15±0.03g）生长性能、消化代谢及免疫指标的影响。试验设计了五组等氮等能饲料,鱼粉组为对照组V0,试验组分别为7%肽组V1、14%肽组V2、7%肽加胆汁酸组V3、14%肽加胆汁酸组V4。每组三个重复,每个重复30尾鱼,试验进行56d。结果表明:各试验组特定生长率、增重率、饲料系数、成活率、肝体比与V0组相比无显著性差异（P＞0.05）;肥满度各试验组均高于V0组。V1、V3组背肌粗蛋白显著高于其他各组（P＜0.05）。V3 V4组血浆中葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、尿素氮、谷草转氨酶含量和肝脏中谷丙转氨酶含量分别显著低于V1 V2组（P＜0.05）,各组总胆汁酸含量无显著性差异（P＞0.05）。全鱼背肌粗脂肪、胃蛋白酶以及大菱鲆蛋白脂肪和干物质表观消化率均为V3 V4组分别显著高于V1 V2组（P＜0.05）;肝脏中脂肪酶活性V3组显著高于V1组（P＜0.05）且V4组高于V2组。综上所述:酶解肽替代部分鱼粉后加入胆汁酸对大菱鲆生长性能、脂肪累积、消化代谢和免疫有一定的促进作用,因此酶解肽高比例替代鱼粉蛋白饲料加入胆汁酸效果较好。

关键词：酶解肽大菱鲆胆汁酸生长性能消化代谢免疫

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藻蓝蛋白酶解肽的分离纯化及其细胞毒活性

食品科学 2012年第1期33卷 136-140页

作者：王雪青邓伟杨进芳毛羽聪史中明天津市食品与生物技术重点实验室天津商业大学生物技术与食品科学学院天津300134

研究钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻蓝蛋白(C-phycocyanin,C-PC)及其胰蛋白酶水解肽的分离纯化。采用反复冻融和超声破碎法破碎细胞,用28～55g/100mL硫酸铵沉淀反复盐析获得纯度(A620nm/A280nm)为2.19的藻蓝蛋白,再通过羟基磷灰石(... 详细信息

研究钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻蓝蛋白(C-phycocyanin,C-PC)及其胰蛋白酶水解肽的分离纯化。采用反复冻融和超声破碎法破碎细胞,用28～55g/100mL硫酸铵沉淀反复盐析获得纯度(A620nm/A280nm)为2.19的藻蓝蛋白,再通过羟基磷灰石(HA)柱层析和Sephacryl S-200 HR凝胶层析对其进行纯化,得到纯度(A620nm/A280nm)为3.89藻蓝蛋白。纯化后的藻蓝蛋白在40℃条件下经胰蛋白酶酶解60min后,用DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析对酶解肽产物进行分离,收集得到4组藻蓝蛋白酶解肽。采用MTT方法,研究藻蓝蛋白、酶解混合液、分离的4个酶解肽组分对肿瘤细胞系HeLa和293T增殖的影响。结果显示:肽组分1和4对HeLa细胞的抑制率分别为37.71%和47.04%,而混合肽和藻蓝蛋白抑制率分别为34.02%和26.03%,因此活性肽组分1和4显示出较好的肿瘤抑制效果,而这两种活性肽组分对正常细胞293T并无细胞毒活性,特别是组分4效果最明显,是极具开发潜力的保健产品。

关键词：藻蓝蛋白纯化酶解肽细胞毒活性

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伴大豆球蛋白酶解肽抑菌活性研究

畜牧与兽医 2012年第12期44卷 10-13页

作者：陈文芳左伟勇李倬苏治国江苏畜牧兽医职业技术学院兽医系江苏泰州225300 西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030

建立伴大豆球蛋白酶解产生抑菌肽的最适条件,对酶解产物进行分离纯化后进一步测定其抑菌活性。采用复合风味蛋白酶水解伴大豆球蛋白,测定不同时间的酶解液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果显示:2 h水解产生的酶解肽具有抑菌... 详细信息

建立伴大豆球蛋白酶解产生抑菌肽的最适条件,对酶解产物进行分离纯化后进一步测定其抑菌活性。采用复合风味蛋白酶水解伴大豆球蛋白,测定不同时间的酶解液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果显示:2 h水解产生的酶解肽具有抑菌活性,其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别是2.6和3.2 mg/mL。2 h水解液经Sephadex-G15分离纯化,采用平板计数法鉴定各组分。结果显示:CP2组分对大肠杆菌具有显著的抑制作用(P酶解肽具有一定的抑菌活性。

关键词：伴大豆球蛋白酶解肽抑菌活性

乳清蛋白酶解肽与鸡蛋清蛋白酶解肽联合作用下的抗氧化效应

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食品工业 2014年第12期35卷 172-176页

作者：饶胜其方维明扬州大学食品科学与工程学院扬州225127

牛乳蛋白和鸡蛋蛋白及其水解产物均具有较高的生物效价和营养价值。将制备得到的乳清蛋白酶解液MWPH和鸡蛋清蛋白酶解液EWPH以及相应分级组分M_Fs和E_Fs分别按照肽质量比1︰1进行两两复配,并通过Chou-Talalay联合指数(CI)分析复配酶解... 详细信息

牛乳蛋白和鸡蛋蛋白及其水解产物均具有较高的生物效价和营养价值。将制备得到的乳清蛋白酶解液MWPH和鸡蛋清蛋白酶解液EWPH以及相应分级组分M_Fs和E_Fs分别按照肽质量比1︰1进行两两复配,并通过Chou-Talalay联合指数(CI)分析复配酶解液和复配分级组分对总还原能力、羟自由基清除能力以及DPPH自由基清除能力的协同效应。研究表明,酶解液MWPH和EWPH具有显著的协同还原能力,而相应分级组分M_Fs和E_Fs具有显著的协同还原能力以及协同DPPH和羟自由基清除能力。同时还表明,超滤和树脂粗分离能有效增强酶解液的协同抗氧化能力。

关键词：乳清蛋白鸡蛋清蛋白酶解肽联合作用抗氧化效应

大鲵肉酶解肽制备及抗氧化与免疫调节活性研究

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大鲵肉酶解肽制备及抗氧化与免疫调节活性研究

作者：贺屹潮陕西理工大学

学位级别：硕士

免疫活性肽是能提高机体免疫功能的多肽。《本草纲目》记载大鲵肉具有提高机体免疫调节能力的作用,但尚未有较详细的实验证明。通过对大鲵肉进行酶解制备多肽,用体内外细胞免疫性实验评价大鲵肉酶解肽的免疫活性,以证明大鲵肉酶解肽具... 详细信息

免疫活性肽是能提高机体免疫功能的多肽。《本草纲目》记载大鲵肉具有提高机体免疫调节能力的作用,但尚未有较详细的实验证明。通过对大鲵肉进行酶解制备多肽,用体内外细胞免疫性实验评价大鲵肉酶解肽的免疫活性,以证明大鲵肉酶解肽具有提高机体免疫的功能,为大鲵肉酶解肽开发增强免疫功能保健产品提供依据。研究主要的结果如下:1.大鲵肉酶解肽的制备。分别用风味蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶对大鲵肉进行了酶解,酶解条件分别为pH 7.0、8.0、7.0,温度50°C、55°C、50°C,酶解时间为3 h,制备得到水解度分别为10.36%、28.55%、15.58%,得率分别为16.59%、18.27%、10.10%的三种大鲵肉酶解肽。凝胶渗透色谱(GPC)结合内标法发现,三种大鲵肉酶解肽的分子量分布集中在5 kDa以下,5 kDa以下分别占97.65%、99.73%和99.64%。Tricine-SDS-PAGE电泳分析发现,分离胶在4.1 kDa和14.4 kDa上出现两个条带。体外免疫性结果表明,三种大鲵肉酶解肽对RAW 264.7巨噬细胞的增殖率在浓度400μg/mL时,分别为35.97±1.56%、17.96±0.49%和16.57±0.78%,选用风味蛋白酶制备大鲵肉酶解肽。大鲵肉风味蛋白酶酶解肽经Sephadex G-25凝胶过滤层析分离获得4个组分,在50μg/mL时对RAW 264.7巨噬细胞的增殖能力依次为9.73±6.97%、23.23±7.23%、2.81±4.39%和39.2±0.91%,四号组分具有较强的细胞增殖能力。2.大鲵肉风味蛋白酶酶解肽有抗氧化性。体外抗氧化性结果为,在10 mg/mL时对DPPH自由基的清除率为65.01±0.24%,其IC为3.54 mg/mL;在2.5 mg/mL对超氧阴离子自由基的清除率为50.98±0.41%,其IC为2.47 mg/mL;在2 mg/mL对亚铁离子螯合能力为74.11±0.42%,其IC为1.14 mg/mL。体内抗氧化结果表明,大鲵肉风味蛋白酶酶解肽可在血清、心脏、肝脏和肾脏中都显著提高GSH-Px的活力(p酶解肽可在血液和心脏中显著提高SOD活力(p酶解肽有免疫调节活性。利用灌胃环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,并灌胃不同剂量的大鲵肉风味蛋白酶酶解肽,100 mg/mL的大鲵肉风味蛋白酶酶解肽能显著提高正常小鼠脾淋巴细胞增殖能力、免疫低下小鼠的巨噬细胞吞噬活性和IL-6的分泌(p0.05)。

关键词：大鲵酶解肽抗氧化活性脾淋巴细胞增殖率巨噬细胞吞噬活性免疫因子