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莱克多巴胺、已烯雌酚、甲硝唑的抗原合成及酶联免疫检测法的建立

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莱克多巴胺、已烯雌酚、甲硝唑的抗原合成及酶联免疫检测法的建立

作者：佟宇川吉林大学

学位级别：硕士

随着中国的近些年经济的发展以及在国际中地位的提高，中国的食品的世界化贸易也有了很大发展，现在的生活水平使得人们对各种肉类食品的需求有了极大的增长，以至现在的畜牧业和养殖业在中国也得到了迅速的发展。然而，由于绝大多数的... 详细信息

随着中国的近些年经济的发展以及在国际中地位的提高，中国的食品的世界化贸易也有了很大发展，现在的生活水平使得人们对各种肉类食品的需求有了极大的增长，以至现在的畜牧业和养殖业在中国也得到了迅速的发展。然而，由于绝大多数的养殖户缺乏科学知识和法律、健康等方面的常识，再加上有巨大的经济利益的驱使，很多的养殖户均超标使用药物或滥用违各种禁药物，近几年来从三聚氰胺到瘦肉精，各种有害抗生素添加剂和生长促进剂的残留不仅危害到消费者的身体健康，对人体产生诸如致癌，致突变等毒副作用，引起细菌耐药性的增加，而且同时影响我国畜禽产品的进出口贸易。目前，食品中药物残留检测方法主要有色谱法、免疫法和微生物检测法。色谱法优点是测定精确，但是仪器昂贵，前处理较麻烦且要求专业人员操作，无法实现大量快速检测，微生物法简单，但只能定性分析，不能定量分析，往往会高出最高检测量，灵敏度不高。而我们所研究的酶联免疫法克服了以上方法的缺点，既可以大批量定性分析，又可以精确定量分析而且前处理简单，检测迅速，有着广阔的发展前景。在对ELISA方法的研究中，很多研究人员合成了各种免疫原，免疫后得到抗体，但做这方面的多数为生物方面专家，对各种药物的改造多数都只用简单化学方法连接，做法简单粗糙，后处理只是简单浓缩干燥等，没有合理的合成处理，更没有纯化，及相关表征，往往只是简单的分析是否有间隔臂接上，使其后抗原和抗体效果有好有坏难以稳定。本论文中，我用几种方法对莱克多巴胺，已烯雌酚，甲硝唑几个药物进行了精确全合成，并有效进行了纯化。在连接蛋白的方法上也进行了一定的改进，并对结果进行了相关测定和分析。并用与BSA连接的免疫原免疫新西兰兔得到了莱克多巴胺，已烯雌酚的多克隆抗体。然后用ELISA方法研究抗体与抗原的效价、灵敏度等。本文主要分两个部分： 1）莱克多巴胺，已烯雌酚，甲硝唑的半抗原用多种方法进行全合成及抗原制备。本文分别通过琥珀酸酣，戊二酸酣，4-溴丁酸乙酯，碘乙酸与药物进行连接，合成多个半抗原，并对莱克多巴胺进行了多个活性位点反应。 2）莱克多巴胺，已烯雌酚，甲硝唑的抗体制备，以及ELISA检测方法的建立。用合成的免疫原制备对应的多克隆抗体，精选其中最好的进行分离纯化后，建立ELISA检测方法，分别对各抗原的不同合成方法，进行对比各种方法合成效果以及不同活性基团的连接效果。

关键词：莱克多巴胺已烯雌酚人工抗原酶联免疫检测法药物残留

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HPV新型夹心酶联免疫检测法的建立及验证

标记免疫分析与临床 2017年第10期24卷 1187-1192页

作者：周松伟兴化市人民医院检验科江苏兴化225700

目的建立一个新型夹心酶联免疫检测系统,为宫颈涂片中高危HPV病毒的检测提供参考。方法使用兔抗HPV16/18/45 E7蛋白的兔单克隆抗体作为包被抗体,使用生物素化的多克隆山羊抗血清作为第二抗体,利用夹心ELISA分别对HPV 16/18/45 E7重组蛋... 详细信息

目的建立一个新型夹心酶联免疫检测系统,为宫颈涂片中高危HPV病毒的检测提供参考。方法使用兔抗HPV16/18/45 E7蛋白的兔单克隆抗体作为包被抗体,使用生物素化的多克隆山羊抗血清作为第二抗体,利用夹心ELISA分别对HPV 16/18/45 E7重组蛋白、宫颈癌细胞和宫颈涂片裂解液中的HPV进行检测。结果确定每孔0.5 pg的HPV 16/18/45 E7蛋白含量为检测限。宫颈涂片HPV检测结果显示,15个为阳性(HPV 16:12个;HPV 18:10个),35个为阴性,与其HPV DNA分型一致。结论本研究建立并验证的新型夹心ELISA法可用来检测3种最普遍的宫颈癌高危HPV类型中的E7蛋白,值得在临床检测中推广。

关键词：人乳头瘤病毒酶联免疫检测法 HPV 16/18/45 E7癌蛋白宫颈癌

PCR产物酶联免疫检测法在乳腺癌临床检验中的应用价值

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中国民康医学 2019年第12期31卷 123-124页

作者：姚振宇佳木斯市肿瘤结核医院检验科

目的:分析PCR产物酶联免疫检测法在乳腺癌临床检验中的应用价值。方法:选取75例乳腺癌患者作为研究对象,对纳入研究的患者进行PCR产物酶联免疫检测,以手术病理检查结果作为诊断金标准,分析PCR产物酶联免疫检测对乳腺癌的诊断效能。结果:... 详细信息

目的:分析PCR产物酶联免疫检测法在乳腺癌临床检验中的应用价值。方法:选取75例乳腺癌患者作为研究对象,对纳入研究的患者进行PCR产物酶联免疫检测,以手术病理检查结果作为诊断金标准,分析PCR产物酶联免疫检测对乳腺癌的诊断效能。结果:PCR产物酶联免疫检测诊断乳腺癌的准确度为98.67%(74/75),敏感度为98.67%(74/75)。结论:PCR产物酶联免疫检测法诊断乳腺癌的准确度及敏感度均较高,可为临床治疗方案的确定及实施提供可靠依据。

关键词： PCR产物酶联免疫检测法临床检验应用价值

莱克多巴胺、氯霉素、三聚氰胺药物残留的酶联免疫检测法的建立

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莱克多巴胺、氯霉素、三聚氰胺药物残留的酶联免疫检测法的建立

作者：尹伟伟山东大学

学位级别：硕士

随着食品贸易国际化的发展,人们对动物源性食品的需求量大大增加,因而畜牧养殖业得到了迅速发展。但是,由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使,在养殖业中超标使用药物和滥用违禁药物的现象普遍存在,在我国情况尤为严重。近几年,我国食品... 详细信息

随着食品贸易国际化的发展,人们对动物源性食品的需求量大大增加,因而畜牧养殖业得到了迅速发展。但是,由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使,在养殖业中超标使用药物和滥用违禁药物的现象普遍存在,在我国情况尤为严重。近几年,我国食品出口因药物残留问题被许多国家退货或者销毁,给我国造成了巨大的经济损失,严重损害了我国食品的质量形象。药物残留不仅直接对人体产生急、慢性毒性作用,引起细菌耐药性的增加,还通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成潜在威胁;药物残留对人体的影响主要表现在变态反应和过敏反应、致畸、致突变和致癌作用等方面。动物源性食品中违禁药物的残留问题也越来越成为全世界共同关注的公共卫生问题。做好食品安全工作不仅是保障人类健康,促进畜牧业发展和我国对外贸易的需要,也是国家政治经济稳定的需要。控制动物源性食品中药物残留已经成为目前确保动物源性食品安全的一项重要措施,许多经济发达国家十分重视药物残留监控,颁布了一系列畜产品药物残留管理法规,制定了详尽的药物残留限量标准,严格实施对畜产品药物残留的监控、监督与检测。近年来,我国也高度重视这一问题,为了有效地控制动物源性产品中的药物残留,制定了严格的残留标准和休药期以限制违禁药物在食品中的残留,采取法律、经济、行政和技术手段实行监控,并借鉴国外先进经验和技术,结合我国国情,研究、筛选出一套可行的违禁药物在食品中的残留检测方法。目前国内外采用的残留分析检测方法主要有理化检测法（包括HPLC、LC-MS、LC-MS/MS等仪器法）、微生物检测法、免疫检测法（包括ELISA、RIA、EIA、FIA、MAIA）等。理化检测法准确、稳定、可靠,可以作为标准方法,但仪器设备昂贵,样品前处理复杂,费时,费力,不易普及;微生物检测法往往会高出最高检测量（MRLs）,灵敏度不高。因此必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。免疫检测法中的酶联免疫检测法（包括ELISA、CL-ELISA、MAIA等）克服了以上方法的缺点,是一种快速、灵敏、方便、易普及的检测方法,有着广阔的发展前景。本论文旨在建立莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测法（CL-ELISA）、氯霉素的磁分离酶联免疫检测法（MATA）和三聚氰胺的酶联免疫检测法（ELISA）在对莱克多巴胺的研究中,首先根据其结构特点,利用对氨基苯甲酸法合成了免疫原（Rac-cBSA）,将此免疫原免疫新西兰大白兔制得莱克多巴胺的多克隆抗体,合成免疫原的同时,我们用BDE法合成了包被抗原（Rac-OVA）。然后利用间接CL-ELISA研究莱克多巴胺抗体的亲和度、灵敏度、交叉反应及在牛奶中莱克多巴胺回收率的测定。经检测,IC50是0.45 ppb,检测限为0.001 ppb,线性范围为0.01-10 ppb;该抗体对其它p-兴奋剂交叉反应率很小;莱克多巴胺在牛奶中的添加回收率在78-120%之间,批内变异系数低于18.1%,批间变异系数低于24.7%。在对氯霉素的研究中,通过直接MAIA法测得氯霉素单克隆抗体的亲和度、灵敏度、交叉反应及在牛奶中氯霉素回收率的测定。经检测,氯霉素抗体的IC50是0.05ppb,线性范围为0.005-5 ppb;该抗体仅对琥珀氯霉素有交叉反应（交叉反应率为6.25%）,对其它的酰胺醇类抗生素的交叉反应率很小;检测氯霉素在牛奶中的添加回收率在85.2-113.7%之间,变异系数在9.9-22%之间。在对三聚氰胺的研究中,首先根据其结构特点,利用水溶性碳二亚胺法合成了免疫原（MEL-TG）,将此免疫原免疫小鼠,经过细胞融合与克隆化得到三聚氰胺的单克隆抗体,合成免疫原的同时,我们用同样的方法合成了包被抗原（MEL-BSA）。然后利用间接ELISA法研究了三聚氰胺抗体的灵敏度、交叉反应及在牛奶中三聚氰胺回收率的测定。经检测,IC50是22.6 ppb,检测限为5.0 ppb,线性范围为5.0-405 ppb;该抗体对其它类似物交叉反应率很小;三聚氰胺在牛奶中的添加回收率在70-125%之间,批内变异系数低于12.0%,批间变异系数低于13.0%。通过本课题的研究,成功制备了用于检测莱克多巴胺的多克隆抗体和检测三聚氰胺的单克隆抗体,利用这些抗体,本研究建立了莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测法、氯霉素的磁分离酶联免疫检测法和三聚氰胺的酶联免疫检测法,并且验证了化学发光酶联免疫法和磁分离酶联免疫检测法比起传统的比色酶联免疫检测法具有更好的灵敏度和检测下限,为最终开发商品化的国产化试剂盒奠定了良好的基础,并为其它药物抗体的制备和检测试剂盒的开发开辟了道路。

关键词：莱克多巴胺氯霉素三聚氰胺酶联免疫检测法药物残留

呋喃唑酮代谢物间接竞争酶联免疫检测方法的研究

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食品与发酵工业 2018年第3期44卷 260-265,272页

作者：史晓亚高丽霞黄登宇山西大学生命科学学院山西太原030006 山西大学食品药品快速检测中心山西太原030006 山西省食品药品监督管理局山西太原030006

建立了呋喃唑酮代谢物间接竞争酶联免疫检测法。用活化酯法将卵清蛋白和半抗原连接成为包被原,对包被原和单克隆抗体的稀释倍数,封闭液浓度、竞争时间、酶标二抗孵育时间和显色反应时间进行优化,同时通过灵敏度、特异性、精密度和准确... 详细信息

建立了呋喃唑酮代谢物间接竞争酶联免疫检测法。用活化酯法将卵清蛋白和半抗原连接成为包被原,对包被原和单克隆抗体的稀释倍数,封闭液浓度、竞争时间、酶标二抗孵育时间和显色反应时间进行优化,同时通过灵敏度、特异性、精密度和准确度等指标进行方法学评价。结果显示,最佳条件为:包被原和单克隆抗体稀释倍数分别为800倍和6 400倍,封闭液是1%脱脂乳,竞争时间是60 min,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗孵育时间是45 min,显色时间是15 min。通过建立的标准曲线计算得到线性方程是Y=-0.253X+1.336(R2=0.995),IC50是2.015 ng/m L,线性范围是0.131~30.911 ng/m L,空白猪肉添加回收率是84.8%~90.3%,批内和批间变异系数分别为3.3%~4.1%和4.6%~6.7%。此方法特异性强,准确性、精密度和重现性均良好,可用于动物源性食品中呋喃唑酮代谢物的快速筛查。

关键词：兽药呋喃唑酮酶联免疫检测法

酶联免疫检测法测定水产品中残留氯霉素的研究

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中国食品学报 2006年第5期6卷 133-136页

作者：张胜帮董士华刘继东夏碧琪郑克华温州大学应用技术学院温州325035 温州出入境检验检疫局温州325027

研究了水产品中残留氯霉素的检测方法。采用酶联免疫检测法(ELISA)测定鱼、虾类水产品中残留氯霉素含量,结果表明:检出限为0.009ng/mL,变异系数为3.0%,样品测定的相对偏差为3.4%～7.1%,回收率为92.5%～102.0%。在0.025～2.00ng/mL测定... 详细信息

研究了水产品中残留氯霉素的检测方法。采用酶联免疫检测法(ELISA)测定鱼、虾类水产品中残留氯霉素含量,结果表明:检出限为0.009ng/mL,变异系数为3.0%,样品测定的相对偏差为3.4%～7.1%,回收率为92.5%～102.0%。在0.025～2.00ng/mL测定范围内呈良好的线性关系,相关系数R=0.9993。用ELISA测定水产品中氯霉素残留量,实验结果令人满意。

关键词：酶联免疫检测法残留氯霉素水产品

酶联免疫检测法测定水产品中残留氯霉素的研究

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酶联免疫检测法测定水产品中残留氯霉素的研究

乙型肝炎病毒的液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用探讨

中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层...

作者：张胜帮董士华刘继东夏碧琪郑克华温州大学应用技术学院温州出入境检验检疫局

研究了水产品中残留氯霉素的检测方法。采用酶联免疫检测法（ELISA）测定鱼、虾类水产品中残留氯霉素含量,结果表明：检出限为0．009 ng/mL,变异系数为3．0%,样品测定的相对偏差为3．4%～7．1%,回收率为92．5%～102．0%。在0．025～2．0... 详细信息

研究了水产品中残留氯霉素的检测方法。采用酶联免疫检测法（ELISA）测定鱼、虾类水产品中残留氯霉素含量,结果表明：检出限为0．009 ng/mL,变异系数为3．0%,样品测定的相对偏差为3．4%～7．1%,回收率为92．5%～102．0%。在0．025～2．00 ng/mL 测定范围内呈良好的线性关系, 相关系数 R=0．9993。用 ELISA 测定水产品中氯霉素残留量,实验结果令人满意。

关键词：酶联免疫检测法残留氯霉素水产品

来源： cnki会议评论

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现代预防医学 2012年第17期39卷 4525-4527页

作者：夏丽娜河南省漯河市中心医院检验科

目的利用液相杂交技术,将核酸杂交技术进行简化,建立乙型肝炎病毒(HBV)的液相杂交的聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA)方法。方法以HBV为目的靶DNA,引物P15’端标记Bio-PCR扩增37个循环。PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混... 详细信息

目的利用液相杂交技术,将核酸杂交技术进行简化,建立乙型肝炎病毒(HBV)的液相杂交的聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA)方法。方法以HBV为目的靶DNA,引物P15’端标记Bio-PCR扩增37个循环。PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,85℃2.5min,60℃1min进行杂交,杂交后产物均经过链霉素亲和素酶标板进行固定,经过酶标仪记录抗地高辛标记抗体,结合、显色。结果液相杂交酶联免疫检测条件的优化:地高辛的探针浓度为2.4pmol/次,液相杂交时间为2.5min,固相杂交时间为100min,检测结果差异无统计学意义(P﹥0.05);本试剂对87份"HBsAg+、HbeAg+、抗HBc+"标本的阳性检出率为91.95%;72例"HBsAg+、抗-Hbe+、抗HBc+"标本的阳性检出率为68.06%,其他免疫检测指标组合标本为16份。结论 HBV的液相杂交技术应用于聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA),该杂交技术的实验操作简便,快速,适合于临床实验室的检测。

关键词：乙型肝炎病毒液相杂交聚合酶链反应酶联免疫检测法

呋喃它酮代谢物间接竞争酶联免疫检测方法的建立

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食品安全质量检测学报 2017年第12期8卷 4809-4817页

作者：李鑫史晓亚高丽霞冯敏高文静黄登宇山西大学生命科学学院太原030006 山西大学食品药品快速检测中心太原030006 山西省食品药品监督管理局太原030006

目的建立呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ)间接竞争酶联免疫检测法。方法通过衍生化反应制备了人工抗原CPAMOZ并用活化酯法将其与鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)连接成为包被... 详细信息

目的建立呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ)间接竞争酶联免疫检测法。方法通过衍生化反应制备了人工抗原CPAMOZ并用活化酯法将其与鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)连接成为包被原CPAMOZ-OVA。对包被原和单克隆抗体的最佳工作浓度、封闭液浓度、竞争时间、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗(horseradish peroxidase labelled goat antimouse Ig G conjugate,HRP-Ig G)、孵育时间和显色反应时间进行优化,并对方法灵敏度、特异性、精密度和准确度进行方法学评价。结果最优条件下,包被原和单克隆抗体稀释倍数分别为500倍和2000倍,封闭液浓度为2%,竞争时间为30 min,二抗孵育时间为30 min,显色时间为15 min。所建立标准曲线的对应线性方程是Y=-0.439X+0.670(r^2=0.992),IC_50为2.439 ng/m L,线性范围为0.506~11.765 ng/m L,回收率为86.7%~90.1%,批内和批间变异系数分别为1.4%~5.8%和2.1%~4.9%。结论该方法特异性强,准确性、精密度和重现性良好,可用于对AMOZ的快速筛查。

关键词：兽药残留呋喃它酮酶联免疫检测法