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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作用研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作...

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作者：梁艳第二军医大学

学位级别：硕士

本研究主要是探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作用,从新的角度揭示原发性胆汁性肝硬化的病理机制。首先应用自行建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测了原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞TRAIL基因... 详细信息

本研究主要是探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作用,从新的角度揭示原发性胆汁性肝硬化的病理机制。首先应用自行建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测了原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞TRAIL基因的表达;然后分别用流式细胞术及酶联免疫吸附术检测膜型及可溶型TRAIL蛋白,分析TRAIL与反映原发性胆汁性肝硬化严重程度的γ-谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶的相关性。接着利用体外正常人肝细胞培养,与不同浓度的TRAIL蛋白和/或胆汁作用,在不同时间点,应用MTT法观察对细胞增殖能力的影响,PI染色法检测DNA含量及细胞周期,Annexin V/PI法检测早晚期凋亡细胞,荧光染色分析线粒体损伤,细胞免疫化学染色法检测bcl-2分子的表达情况。本研究发现原发性胆汁性肝硬化患者外周血TRAIL基因与蛋白表达均明显增高,这种异常表达与原发性胆汁性肝硬化的发生和严重程度密切相关。重组表达的人TRAIL蛋白对正常人肝细胞具有凋亡作用,且有浓度和时间依赖性;胆汁可以促进其凋亡作用。线粒体损伤及bcl-2分子表达降低可能参与TRAIL和/或胆汁诱导正常人肝细胞损伤的作用。

关键词：原发性胆汁性肝硬化肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应肿瘤坏死因子流式细胞术酶联免疫吸附术细胞增殖细胞周期凋亡线粒体

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TRAIL在原发性胆汁性肝硬化患者外周血的表达及作用机制研究

TRAIL在原发性胆汁性肝硬化患者外周血的表达及作用机制研究

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中华医学会第七次全国检验医学学术会议

作者：梁艳杨再兴王皓张玲珍孔宪涛仲人前第二军医大学附属长征医院实验诊断科全军医学免疫诊断中心

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)在原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的表达及在肝损伤中的作用,从临床和细胞水平揭示TRAIL分子对PBC的致病机制。方法:应用自行建立的实时荧光定量RT-PCR法检测30例PBC患者、25例乙肝后肝硬化... 详细信息

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)在原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的表达及在肝损伤中的作用,从临床和细胞水平揭示TRAIL分子对PBC的致病机制。方法:应用自行建立的实时荧光定量RT-PCR法检测30例PBC患者、25例乙肝后肝硬化患者及30例正常人外周血单个核细胞TRAIL基因的表达:流式细胞术及ELISA法检测膜型及可溶型TRAIL蛋白.分析TRAIL与反映疾病严重程度的GGT和ALP的相关性。体外培养正常人肝细胞.与不同浓度的TRAIL蛋白和/或胆汁作用.在不同时间点,应用MTT法观察对细胞增殖的影响,PI染色法检测DNA含量及细胞周期。Annexin V/PI法检测细胞早晚期凋亡。荧光染色分析线粒体损伤,细胞免疫化学染色法检测bcl-2分子的表达。结果:PBC和乙肝后肝硬化患者PBMC中TRAIL mRNA的表达量显著高于健康对照组:单核细胞膜型TRAIL阳性表达率与血浆sTRAIL亦明显高于健康对照.差异有统计学意义(P<0.05):且PBC患者血浆sTRAIL与TNF-α、GGT、ALP浓度呈正相关。20ng/ml及100ng/ml重组人TRAIL蛋白作用3天后对正常人肝细胞有显著抑制作用,10μl/ml胆汁配伍100ng/mlTRAIL较单独加TRAIL或胆汁.抑制作用更明显。各浓度TRAIL和/或胆汁与肝细胞共培养2天后换液,细胞生长抑制率明显降低。100ng/ mlTRAIL作用于肝细胞不同时间,与对照组相比。G0/G1期比例均有升高趋势,S期下降。增殖指数在48h及72h明显下降:10μl/ ml胆汁配伍100ng/mlTRAIL作用48h及72h出现G0/G1期比例明显升高,S期比例下降,且比单独作用更明显。20、100ng/ mlTRAIL或40μl/ml胆汁或胆汁配伍TRAIL作用24h诱导肝细胞早期凋亡率比对照组显著增加.10μl/ml胆汁配伍不同浓度TRAIL较单独胆汁作用。荧光强度较低。表明线粒体损伤严重。肝细胞与100ng/ml TRAIL,10μl/ml胆汁及10μl/ml胆汁配伍100ng/ mlTRAIL分别培养12h后,bel-2的表达降低。结论:PBC患者外周血TRAIL基因与蛋白表达明显增高.且与PBC发生和严重程度密切相关。重组表达的人TRAIL蛋白对正常人肝细胞具有凋亡作用。且有浓度和时间依赖性:胆汁可以促进其凋亡。线粒体损伤及bel-2分子表达降低可能参与TRAIL和/或胆汁诱导PBC患者肝细胞损伤的作用。

关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体原发性胆汁性肝硬化流式细胞术酶联免疫吸附术细胞增殖细胞周期凋亡线粒体

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