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酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草PMT基因启动子结合蛋白中的应用

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作物学报 2014年第12期40卷 2081-2089页

作者：陈红牛海峡王文静马浩然李加纳柴友荣张洪博西南大学农学与生物科技学院重庆400716

筛选DNA结合蛋白常用的酵母单杂交系统在应用中有时会因内源干扰而影响筛选结果。与之相比,酵母表面展示系统(yeast surface display system)将外源蛋白展示在细胞表面,可通过接近体外实验的方法筛选DNA结合蛋白,能在一定程度上避免酵... 详细信息

筛选DNA结合蛋白常用的酵母单杂交系统在应用中有时会因内源干扰而影响筛选结果。与之相比,酵母表面展示系统(yeast surface display system)将外源蛋白展示在细胞表面,可通过接近体外实验的方法筛选DNA结合蛋白,能在一定程度上避免酵母内源干扰,但是,该系统在DNA结合蛋白筛选研究中的应用还很有限。本研究对酵母表面展示系统常用载体p YD1进行改造,使其与Clontech公司的Smart cDNA文库构建系统相匹配,提高了cDNA酵母表面展示文库的构建效率,并通过比较试验建立了一个以酵母表面展示系统筛选DNA结合蛋白的试验体系。在以酵母单杂交筛选烟草腐胺甲基转移酶基因PMT(putrescine N-methyltransferase)启动子结合蛋白的研究中,其茉莉素信号应答元件GAG片段是一段筛选效率极低的DNA片段。本研究利用改进的酵母表面展示系统对GAG片段的DNA结合蛋白进行了筛选,并获得若干烟草蛋白基因,其中包括2个可能结合GAG片段的ERF(ethylene responsive factor)转录因子。进一步研究发现,这2个ERF转录因子可与GAG片段在体外结合,但不能在酵母单杂交系统中激活由GAG片段操纵的报告基因表达。本研究也证明酵母表面展示系统可有效克服酵母内源干扰,弥补酵母单杂交系统在筛选易受酵母内源干扰DNA结合蛋白方面的不足。

关键词：酵母表面展示 Smart c DNA文库 DNA结合蛋白酵母单杂交 PMT基因

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酵母表面展示脂肪酶合成己二酸二异辛酯

生物工程学报 2013年第7期29卷 1027-1031页

作者：张娜金子林影郑穗平韩双艳华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

展示酶的酵母细胞既具有固定化酶的优点,又有制备简单、成本较低的特点。采用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的毕赤酵母细胞催化合成己二酸二异辛酯(Diisooctyladipate,DIOA),对该反应体系进行优化,并... 详细信息

展示酶的酵母细胞既具有固定化酶的优点,又有制备简单、成本较低的特点。采用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的毕赤酵母细胞催化合成己二酸二异辛酯(Diisooctyladipate,DIOA),对该反应体系进行优化,并实现了初步工艺放大制备。经条件优化后,在10 mL反应体系中,DIOA的产率可达85.0%。该工艺放大到200 mL反应体系时,DIOA产率可达97.8%。经减压蒸馏,DIOA纯度可达到98.2%。该酵母表面展示脂肪酶在合成绿色润滑油己二酸二异辛酯中具有良好应用前景。

关键词：酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B 己二酸二异辛酯绿色润滑油

酵母表面展示体系的构建及在纤维素降解中的应用

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中国生物工程杂志 2022年第5期42卷 91-99页

作者：刘明珠张良郭芳李春冯旭东北京理工大学化学与化工学院化学工程系生物化工研究所医药分子科学与制剂工程工业和信息化部重点实验室北京100081 清华大学化学工程系工业生物催化教育部重点实验室北京100084 清华大学合成与系统生物学研究中心北京100084

纤维素是来源广泛且储量较大的低成本可再生资源,但其结构致密难以利用。目前降解纤维素需要多种纤维素酶协作,而游离纤维素酶成本高、难以重复利用等问题限制了其广泛应用。利用酵母表面展示技术,可以将多个纤维素酶分别与锚定蛋白融... 详细信息

纤维素是来源广泛且储量较大的低成本可再生资源,但其结构致密难以利用。目前降解纤维素需要多种纤维素酶协作,而游离纤维素酶成本高、难以重复利用等问题限制了其广泛应用。利用酵母表面展示技术,可以将多个纤维素酶分别与锚定蛋白融合后共展示在细胞表面,从而构建酵母表面展示纤维素酶体系。这一体系可高效降解纤维素,一方面可以充分发挥表面展示的优点,如易回收、稳定性好、操作简单、成本低;另一方面可以将纤维素有效地降解为葡萄糖,并具有代谢产生物乙醇的潜力。阐述了酵母表面展示体系的构建原则,总结了影响展示体系效率的因素,介绍了这一技术在降解纤维素中的应用,为构建高效酵母表面展示纤维素酶体系及其他多酶体系提供参考。

关键词：酵母表面展示纤维素酶锚定蛋白

酵母表面展示系统的优化策略及其在高通量筛选中的应用

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生物工程学报 2024年

作者：商娜刘文婷安吉一李金山郑迎迎中国科学院天津工业生物技术研究所

酵母表面展示技术能够将目标蛋白在酵母细胞表面表达，已在酿酒酵母、毕赤酵母、解脂耶氏酵母等多个酵母种属中成功构建。该技术为蛋白高通量筛选提供了高效的平台，用于对药物和抗体等候选分子以及高分泌细胞进行快速和准确的评估，目... 详细信息

酵母表面展示技术能够将目标蛋白在酵母细胞表面表达，已在酿酒酵母、毕赤酵母、解脂耶氏酵母等多个酵母种属中成功构建。该技术为蛋白高通量筛选提供了高效的平台，用于对药物和抗体等候选分子以及高分泌细胞进行快速和准确的评估，目前已广泛在生物制药、疫苗开发、酶工程和生物材料制备等关键领域应用，促进了生物技术的发展。本文综述了酵母表面展示技术中针对宿主和表达盒元件的优化策略，并深入探讨了该技术在高通量筛选中的应用。同时，也指出了当前技术的局限性，并对未来的发展方向进行了展望，以期为进一步提升筛选的准确性和扩大适用范围奠定基础。

关键词：酵母表面展示优化高通量筛选抗体酶

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高效絮凝素毕赤酵母表面展示系统的构建

生物化学与生物物理进展 2010年第2期37卷 200-207页

作者：韩双艳韩振林林影郑穗平华南理工大学生物科学与工程学院广州510006

为了获得高效的脂肪酶毕赤酵母表面展示系统,利用来自酿酒酵母絮凝素蛋白Flo1的N端874个氨基酸残基(FS)和C端的1101个氨基酸残基(FL)作为锚定蛋白分别构建了2套载体系统.带有前肽的米黑根毛霉脂肪酶(ProRML)克隆到构建的2套展示载体中,... 详细信息

为了获得高效的脂肪酶毕赤酵母表面展示系统,利用来自酿酒酵母絮凝素蛋白Flo1的N端874个氨基酸残基(FS)和C端的1101个氨基酸残基(FL)作为锚定蛋白分别构建了2套载体系统.带有前肽的米黑根毛霉脂肪酶(ProRML)克隆到构建的2套展示载体中,使米黑根毛霉脂肪酶(RML)分别以N端锚定或C端锚定的方式实现在毕赤酵母细胞表面的展示.利用RMLC端的Flag标签,通过流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜检测2套系统中RML在酵母表面的展示情况.研究发现,N端锚定于酵母表面的展示酶FSR以pNPC为底物时,水解活力达到了105.3U/g,大约为C端锚定的展示酶FLR活力的2倍.同时FSR比FLR具有更宽的温度、pH作用范围和更好的热稳定性.与游离酶和固定化酶相比,展示酶FSR也表现出更为优良的热稳定性.结果提示,基于Flo1N端锚定的展示系统更适合展示活性中心近C端的脂肪酶,推动了展示酶的进一步研究和开发.

关键词：酵母表面展示毕赤酵母米黑根毛霉脂肪酶 N端锚定系统 C端锚定系统

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酿酒酵母表面展示技术表达酸性蛋白酶

中国食品学报 2022年第2期22卷 114-122页

作者：黄蓉董超余鸿飞秦义刘延琳宋育阳西北农林科技大学葡萄酒学院陕西杨凌712100

为解决白葡萄酒蛋白不稳定性问题,实现酸性蛋白酶的利用与酒精发酵的同步进行,本研究以酿酒酵母单倍体菌株BY4741和二倍体菌株82-9-35为宿主菌,通过酵母表面展示系统中的启动子和锚定蛋白的作用在酵母细胞表面表达酸性蛋白酶。将来源于... 详细信息

为解决白葡萄酒蛋白不稳定性问题,实现酸性蛋白酶的利用与酒精发酵的同步进行,本研究以酿酒酵母单倍体菌株BY4741和二倍体菌株82-9-35为宿主菌,通过酵母表面展示系统中的启动子和锚定蛋白的作用在酵母细胞表面表达酸性蛋白酶。将来源于宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因(pepA)克隆,构建表达酸性蛋白酶的细胞展示盒,利用同源重组定点整合酸性蛋白酶基因到酿酒酵母的基因位点。经过PCR和测序验证,获得两株可细胞表面展示酸性蛋白酶的单倍体和二倍体的重组菌株,其最高酶活分别是285.71 U/mL和495.24 U/mL。本研究成功构建了利用酿酒酵母细胞壁蛋白SED1作为锚定蛋白的展示系统,为解决葡萄酒中蛋白浑浊的问题提供新思路,为实现pepA酸性蛋白酶全细胞催化剂工业化应用奠定理论基础。

关键词：酸性蛋白酶酵母表面展示蛋白沉淀酿酒酵母稳定性

酵母表面展示多肽片段分析Δ42PD1的免疫原性

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中国免疫学杂志 2016年第9期32卷 1333-1337页

作者：程林王子乔徐六妹唐娴周泱王辉深圳市第三人民医院深圳518112

目的:分析Δ42PD1胞外区的免疫原性。方法:将Δ42PD1胞外区编码基因分为6个片段,分别用PCR的方法进行扩增,并克隆至酵母表面展示质粒p CTCON2。分别将重组酵母表达质粒转化酵母细胞,涂布SDCAA平板,挑取单细胞克隆于SGCAA培养基中诱导目... 详细信息

目的:分析Δ42PD1胞外区的免疫原性。方法:将Δ42PD1胞外区编码基因分为6个片段,分别用PCR的方法进行扩增,并克隆至酵母表面展示质粒p CTCON2。分别将重组酵母表达质粒转化酵母细胞,涂布SDCAA平板,挑取单细胞克隆于SGCAA培养基中诱导目的基因的表达。通过肌肉注射Δ42PD1真核表达质粒加局部电穿孔的方法免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗人Δ42PD1免疫血清。用流式细胞术的方法分析免疫血清与酵母表面展示的Δ42PD1多肽片段的结合。结果:PCR扩增的Δ42PD1的6个片段的编码序列全长均110 bp,核酸序列分析显示克隆的目的基因与Gen Bank中已经登记的PD1基因序列100%同源;流式细胞术的结果发现酵母表面展示的Δ42PD1的F3和F2片段可与Δ42PD1的免疫血清发生明显结合。结论:Δ42PD1的F3和F2片段是该分子的免疫优势区域,为制备Δ42PD1的单克隆抗体及表位筛选奠定了基础。

关键词：程序性细胞死亡受体1 Delta-42程序性细胞死亡受体1 酵母表面展示免疫原性流式细胞术

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

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生命科学研究 2014年第6期18卷 477-482页

作者：梁秀怡梁志成朱筱刘诗雨张智田生礼深圳大学生命科学学院深圳市微生物基因工程重点实验室中国广东深圳518060 深圳大学生命科学学院深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室中国广东深圳518060

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形... 详细信息

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。

关键词： T载体酵母表面展示真核表达 XcmⅠ酶切盒

南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母表面展示及其催化己酸乙酯的合成

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生物工程学报 2008年第4期24卷 673-678页

作者：潘志友韩双艳林影郑穗平华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室广州510006

从南极假丝酵母(Candida antarctica)基因组克隆得到南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B,CALB)全基因片段,利用连接肽celA Linker将CALB与酿酒酵母细胞表面展示蛋白α-凝集素的C端连接融合,构建表面展示载体pICAS-celAL-C... 详细信息

从南极假丝酵母(Candida antarctica)基因组克隆得到南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B,CALB)全基因片段,利用连接肽celA Linker将CALB与酿酒酵母细胞表面展示蛋白α-凝集素的C端连接融合,构建表面展示载体pICAS-celAL-CALB,转化酵母后获得重组酵母菌Saccharomyces cerevisiae pICAS-celAL-CALB。该重组酵母菌经葡萄糖诱导表达及分析,表明CALB已在酿酒酵母细胞表面成功展示,水解活力达26.26 u/(g·dry cell)。重组酵母菌经冻干能有效地实现在非水相中全细胞催化己酸和乙醇酯化合成己酸乙酯。反应物己酸与乙醇的摩尔比为1:1.25,己酸乙酯的产率为98.0%,具有较好的操作稳定性。

关键词：酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B 全细胞催化己酸乙酯