检索结果-南通市图书馆

宁夏农林科技 2012年第2期53卷 31-32页

作者：张开慧宝鸡职业技术学院陕西宝鸡721013

酵母单杂交技术是一种体外分析DNA与蛋白质相互作用的技术。文章就酵母单杂交技术的原理、操作步骤、应用及其优缺点作了简要概括。

关键词：酵母单杂交技术 DNA 蛋白质

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酵母单杂交技术的原理及应用

世界华人消化杂志 2003年第4期11卷 450-451页

作者：马守东洪源成军中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心

0引言酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法,通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因,或对DNA结合位点进行分析.运用此技术,能筛选到与DNA结合... 详细信息

0引言酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法,通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因,或对DNA结合位点进行分析.运用此技术,能筛选到与DNA结合的蛋白质,并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列,而无需复杂的蛋白质分离纯化操作,故在蛋白研究中,具有一定的优势;而且,酵母属真核细胞,通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况.

关键词：酵母单杂交技术原理基因蛋白质真核细胞基因表达转录因子反式激活因子大鼠腺苷酸转位酶

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

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中西医结合肝病杂志 2003年第6期13卷 337-339页

作者：洪源成军中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵... 详细信息

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选,应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果:共获得了12个双阳性克隆,编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白,其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论:这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合,可能是作用于SPⅠ的反式作用因子,但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用,笔者正进行进一步的研究。

关键词：酵母单杂交技术乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ 结合蛋白病毒复制

草莓AP2/ERF转录因子AD-cDNA文库的构建

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果树学报 2018年第7期35卷 777-784页

作者：肖宇玮张圆圆张祖瑛李绍佳殷学仁陈昆松浙江大学农业与生物技术学院果树研究所杭州310000

【目的】探究AP2/ERF家族成员在果实成熟过程中发挥的作用。【方法】利用CTAB法提取栽培草莓(Fragaria×ananassa)品种‘越心’的果实RNA,逆转录第1链c DNA;根据AP2 DNA-binding domain序列信息利用CDART工具在Genbank中获得草莓中所有A... 详细信息

【目的】探究AP2/ERF家族成员在果实成熟过程中发挥的作用。【方法】利用CTAB法提取栽培草莓(Fragaria×ananassa)品种‘越心’的果实RNA,逆转录第1链c DNA;根据AP2 DNA-binding domain序列信息利用CDART工具在Genbank中获得草莓中所有AP2/ERF家族成员的序列信息,设计基因编码区全长引物并获得所有家族成员全长序列;将AP2/ERF家族成员基因全长序列从测序载体p GEM-T easy转移至p GADT7载体上,转化至大肠杆菌并保存菌株,构建完整的AP2/ERF AD-c DNA文库;参照YeastmakerTMyeast transformation system2(Clontech)说明书,利用Dk PDC2启动子进行文库筛选和单一验证。【结果】从数据库获得了草莓(Fragaria×ananassa)基因组120个非冗余AP2/ERF家族成员基因全长序列,通过设计的7条引物将AP2/ERF家族成员基因全长序列从测序载体p GEM-T easy转移至p GADT7载体上,转化至大肠杆菌并保存菌株,构建了完整的AP2/ERF的AD-c DNA文库。利用已报道能与Dk ERF19互作的柿子基因Dk PDC2启动子对该文库进行酵母单杂交筛选,获得了2个草莓AP2/ERF家族成员Fa ERF#83和Fa ERF#87,且证明了两者均能与Dk PDC2启动子互作。【结论】成功构建了一个只含有草莓AP2/ERF转录因子全长序列的AD-c DNA文库,用Dk PDC2启动子进行筛选获得了Dk ERF19直系同源基因Fa ERF#87和同亚家族基因Fa ERF#83,证明了该文库的有效性,也为进一步研究潜在的AP2/ERF调控提供了手段。

关键词：草莓 AP2/ERF转录因子 cDNA文库酵母单杂交技术

白桦E-box元件的载体构建及与BplMYB46转录因子的互作分析

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生物技术通报 2018年第12期34卷 110-115页

作者：王博王莲萍杨春雨国会艳魏继承牡丹江师范学院生命科学与技术学院牡丹江157011

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族成员之一,主要参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答,在植物的生长发育中起着至关重要的作用。已有研究发现,E-box的核心序列为CANNTG(N:A/G/C/T),是一类与光响应和苯丙氨酸生物合成途径... 详细信息

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族成员之一,主要参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答,在植物的生长发育中起着至关重要的作用。已有研究发现,E-box的核心序列为CANNTG(N:A/G/C/T),是一类与光响应和苯丙氨酸生物合成途径相关的元件。在前期研究中,先构建顺式作用元件库,然后以转录因子为中心的酵母单杂交技术筛选发现,白桦的BplMYB46转录因子能够与核心序列为CAAATG的E-box顺式作用元件结合。但是,是否能与E-box的其他核心序列结合还不清楚。本研究将每一种E-box顺式作用元件的核心序列分别进行双链DNA的复性并连接到pHIS2载体上,然后通过酵母单杂交技术筛选与BplMYB46转录因子能够特异结合的E-box顺式作用元件。结果显示,当E-box的核心序列第3个碱基为A/T/C、第四个碱基为A/G/C时,酵母单菌落能在三缺培养基TDO/3AT上生长,表明与BplMYB46转录因子结合的E-box顺式作用元件的特异性序列为CA(A/T/C)(A/G/C)TG。为后续通过BplMYB46转录因子与E-box顺式作用元件的结合来分析BplMYB46转录因子对下游基因的调控,以及为筛选优良下游基因改良白桦的遗传性状奠定数据基础。

关键词： BplMYB46转录因子 E-box顺式作用元件酵母单杂交技术

粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL32-2的基因转录调控因子筛选研究

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粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL32-2的基因转录调控因子筛选研究

作者：董清南京师范大学

学位级别：硕士

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的核糖体蛋白RPL32的两个同源蛋白RPL32-1和RPL32-2在功能上既有类似可以相互替代的方面,同时也存在功能的分化。本实验室在前期研究中发现,RPL32-1,-2这两个同源蛋白在细胞不同生长阶段具有不... 详细信息

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的核糖体蛋白RPL32的两个同源蛋白RPL32-1和RPL32-2在功能上既有类似可以相互替代的方面,同时也存在功能的分化。本实验室在前期研究中发现,RPL32-1,-2这两个同源蛋白在细胞不同生长阶段具有不同表达以及不同的生理意义,当RPL32的总蛋白量保持不变时,同源基因相互竞争抑制另一个同源基因的表达;当细胞处于沉默状态时,RPL32-1高表达抑制细胞分裂;而细胞处于对数期时,RPL32-2呈现高表达促进细胞分裂。然而RPL32-1, RPL32-2为什么会在不同时期有不同的表达量?产生这样功能分化的原因是什么呢?由此本文开展了RPL32-2转录调控因子的研究。我们首先利用酵母单杂交技术对rp132-2的启动子的转录因子进行筛选。本研究构建了高质量的酵母cDNA文库,利用构建的带有rp132-2启动子的诱饵菌株,从cDNA文库中筛选可能的rp132-2转录因子,共获得109个阳性克隆。对获得的阳性克隆cDNA序列分析,经过NCBI比对得出了43种可能的结合蛋白,通过统计学分析,出现频率较高的可能的结合蛋白有6种,其中有五种核糖体蛋白RPS6-1, RPL5-2, RPS10-1, RPL27-1, RPL5-1以及一种翻译延伸因子EF1B,其出现频率分别为11.93%,11.93%,8.26%,6.42%,5.50%,11.01%。推测这些蛋白有可能是rp132-2的转录因子。为验证上述假说,我们通过构建pGADT7+rps6-1, pGADT7+rps10-1, pGADT7+rpl5-1, PGADT7+rpl5-2, pGADT7+rpl27-1, pGADT7+ef1b重组质粒,通过再转化实验进一步验证,结果发现RPL5-1,RPL5-2,RPS6-1均可能与rp132-2的启动子产生相互作用。我们得出结论RPL5-1, RPL5-2, RPS6-1都有可能是rp132-2的转录因子。但由于单杂交实验本身存在一定的局限性,存在假阳性的可能,所以我们需要通过其他的验证实验。本文针对rp132-2启动子与核糖体蛋白RPL5-1之间有无相互作用,通过染色质免疫共沉淀实验(ChIP)从体内进行验证。我们首先构建带有RPL5-1-HA标签的酵母菌株,利用HA抗体进行染色质免疫共沉淀,以ChIP的纯化产物为模板进行PCR扩增,但并没有从中扩增出rp132-2启动子DNA片段。所以我们得出结论,rp132-2的启动子与RPL5-1蛋白之间没有相互作用,之前的单杂交实验结果为假阳性。至于利用酵母单杂交筛选得出的其余的rp132-2的启动子的可能结合蛋白也需要进一步验证。

关键词：粟酒裂殖酵母酵母单杂交技术转录因子核糖体蛋白染色质免疫共沉淀

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西方蜜蜂mrjp1基因的转录调控机理研究

西方蜜蜂mrjp1基因的转录调控机理研究

作者：秦凯鑫江西农业大学

学位级别：硕士

王浆主蛋白(MRJPs)为蜂王浆主要蛋白质部分,具有重要作用。本论文通过ATAC-seq分析初步筛选调控mrjp1的转录因子,并为蜜蜂咽下腺生长发育机理提供理论基础。利用PCR扩增、克隆、测序和双荧光素酶报告基因实验对mrjp1启动子进行了鉴定及... 详细信息

王浆主蛋白(MRJPs)为蜂王浆主要蛋白质部分,具有重要作用。本论文通过ATAC-seq分析初步筛选调控mrjp1的转录因子,并为蜜蜂咽下腺生长发育机理提供理论基础。利用PCR扩增、克隆、测序和双荧光素酶报告基因实验对mrjp1启动子进行了鉴定及转录活性分析。通过酵母单杂交技术筛选出参与调控mrjp1转录的转录因子,运用RNAi技术对候选转录因子进行验证。ATAC-seq分析结果显示,我们在出房蜂(NEW)、哺育蜂(Nurse)和采集蜂(Forager)阶段分别检测到1141、2353和1406个独有peaks。在NEW vs Nurse、Nurse vs Forager和Forager vs NEW三个比较组中,分别鉴定出894、575和2658个差异peaks,分别对应611、515和1584个基因。此外,在NEW vs Nurse、Nurse vs Forager和Forager vs NEW三个比较组中,分别鉴定出42、126和235个高度富集的已知motif(q酵母单杂交文库筛选。酵母单杂交结果显示,我们共筛选出61个候选蛋白。最终,我们挑选5个蛋白进行后续回转验证和点板验证实验,结果表明这5个蛋白均与mrjp1互作。5个候选转录因子基因在西方蜜蜂咽下腺表达情况结果显示,在哺育和采集蜂阶段,atf-4、nuclear protein 1、spt20和crtc1表达量均显著高于出房蜂(p0.05)。通过RNAi验证5个候选转录因子是否参与调控mrjp1启动子区域,结果显示,atf-4和spt20表达降低时,mrjp1表达也会显著降低(p0.05)。蛋白平行检测结果显示,干扰atf-4或spt20基因后,ATF-4或SPT20与MRJP1的表达量均有下降趋势。

关键词：西方蜜蜂 mrjp1 ATAC-seq 酵母单杂交技术 RNAi

白桦应拉木形成代谢组学分析及BpMYB4基因表达和功能分析

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白桦应拉木形成代谢组学分析及BpMYB4基因表达和功能分析

作者：张楠东北林业大学

学位级别：硕士

MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。这些转录因子广泛参与植物的各种发育和代谢的调节,如细胞分化、细胞周期的调节、激素和环境因子应答,并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。本文通过对白桦... 详细信息

MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。这些转录因子广泛参与植物的各种发育和代谢的调节,如细胞分化、细胞周期的调节、激素和环境因子应答,并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。本文通过对白桦形成层相关组织的cDNA文库序列进行同源性比对,获得了AtMYB4的同源基因,命名为BpMYB4。本论文对其进行一系列研究:利用实时荧光定量PCR分析BpMYB4基因的组织表达特性。结果表明:BpMYB4基因在不同组织中均有表达,其中在花组织中的表达量最高,这与转录抑制因子的表达特性相似;BpMYB4基因在应力木形成中表达分析结果显示,应拉木中该基因表达量升高,初步认定BpMYB4是木质素生物合成的抑制因子。利用染色体步移法获得BpMYB4基因启动子,生物信息学分析发现该启动子中含有与细胞分裂素相关元件,与花药和花粉发育相关元件,赤霉素响应元件,Dof蛋白结合位点,参与冷冻胁迫和脱落酸响应的元件等;该启动子驱动GUS表达结果显示,该基因在白桦茎、叶柄和芽中表达,这与利用实时定量PCR进行的组织表达特性分析结果一致,推测白桦BpMYB4基因可能参与维管组织的发育。构建了白桦BpMYB4基因的过表达载体pROK Ⅱ-BpMYB4及抑制表达RNAi-BpMYB4,电击转化农杆菌,并对白桦组培苗进行瞬时侵染,实时定量PCR分析表明,过表达株系BpMYB4的表达量上调10倍;抑制表达株系BpMYB引的表达量下调28倍,说明构建的表达载体据有过表达和抑制表达功能。构建了融合载体pROKⅡ-BpMYB4-GFP,利用基因枪转化法轰击洋葱表皮,结果表明,BpMYB4基因在细胞核内表达。将所构建的融合表达载体pROK Ⅱ-BpMYB4-GFP通过农杆菌介导法转入拟南芥。发现转基因植株的茎与野生型相比,生长速度加快,茎的分枝增多。木质素及纤维素含量测定结果显示,转基因株系的纤维素含量有明显的升高,木质素含量略有降低。徒手切片染色观察分析结果显示,转基因拟南芥的木质素含量降低。利用酵母单杂交技术,在随机元件文库中筛选出与BpMYB4互作的元件,即ACGTATERD1、CGACGOSAMY3、DOFCOREZM、LTRECOREATCOR15、TAAAGSTKST1。这些元件具有脱水响应,参与碳代谢,参与茎组织特异性表达,冷诱导,控制气孔生长响应等作用,推测白桦BpMYB4基因可能通过特异性识别这些元件来参与脱水响应、茎组织的碳代谢、低温诱导、气孔变化、组织特异表达等过程。将已知拟南芥细胞壁合成相关纤维素合成酶基因的启动子主要顺式作用元件与pHIS2连接,利用酵母单杂交技术,与7个拟南芥MYB转录因子进行互作分析,发现已知元件MYBST1与拟南芥AtMYB61基因互作。进一步分析结果显示,元件所在纤维素合成酶基因AtCEV1的启动子片段和拟南芥AtMYB61基因互作。表明AtMYB61可以通过MYBST1元件与AtCEV1基因互作调节纤维素合成代谢。生物信息学分析结果显示AtMYB61与BpMYB4的同源性达到61%,这两个基因在纤维素合成中的具体调控功能有待进一步研究。利用代谢组学对白桦应力木中木质部形成层相关代谢产物进行分析,发现白桦树干在弯曲处理后,有142种代谢产物发生变化,如葡萄糖1磷酸、葡萄糖醛酸、木糖醇、核糖醇、莽草酸、松柏醇等,研究发现,白桦应拉木可以通过改变木质纤维素合成过程中的代谢物,从而促进纤维素的合成,抑制木质素的合成。

关键词：白桦 BpMYB4 木质素纤维素合成酶酵母单杂交技术代谢产物

白桦NAC转录因子调控次生细胞壁形成和非生物胁迫反应的分子机制

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白桦NAC转录因子调控次生细胞壁形成和非生物胁迫反应的分子机制

作者：崔志远东北林业大学

学位级别：硕士

NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,广泛分布于苔鲜植物到高等双子叶植物,其主要参与植物次生生长,激素调控和信号转导以及对环境因子的应答。本研究首先通过对白桦应力木转录组的分析得到了 24条全长的BpNAC基因,之后对这24条... 详细信息

NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,广泛分布于苔鲜植物到高等双子叶植物,其主要参与植物次生生长,激素调控和信号转导以及对环境因子的应答。本研究首先通过对白桦应力木转录组的分析得到了 24条全长的BpNAC基因,之后对这24条BpNAC基因的序列特征进行了分析,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对它们在不同组织、不同处理时间的应力木次生木质部和不同时期整株白桦的表达特性进行了分析。结果表明,这些基因在不同组织中的表达是具有特异性的,在不同处理时间的应力木中各基因呈现出不同的表达趋势,相对于直立木总体可形成上调表达和下调表达两种表达模式,在不同时期整株白桦的次生木质部中不同基因的表达具有一定特异性,但总体表达趋势是相一致的。综合序列与表达模式分析结果,本论文选取了 BpNAC5基因进行进一步研究,分析其在细胞壁发育和逆境胁迫中的功能。将BpNAC5基因与GFP基因融合,利用基因枪法转化到洋葱表皮细胞中进行亚细胞定位研究,结果表明BpNAC5基因定位在细胞核中。克隆了BpNAC5基因的启动子,利用生物信息学程序对该启动子序列进行了顺式作用元件分析,检测到多个与逆境胁迫响应相关的元件,推测该基因与逆境胁迫响应相关。将BpNAC5基因的启动子定向替换表达载体中的35S启动子,构建了BpNAC5启动子驱动GUS的植物表达载体,利用瞬时转化法侵染白桦的茎段、叶片和芽尖,结果显示白桦茎段和叶片均有不同程度的染色,茎段染色较深,表明BpNAC5启动子能够启动报告基因的表达,而且与植物的次生木质部发育相关。构建过表达载体进行拟南芥转基因,对过表达株系和野生型进行次生生长诱导,观察其表型,结果显示过表达株系的抽茎时期相对于野生型会延后,但最终过表达株系的株高要高于野生型;细胞壁组分分析结果显示,过表达株系的纤维素含量相对于野生型明显增加,木质素含量差异不显著,而半纤维素含量有所减少;对过表达拟南芥株系和野生型的茎基部分别进行冷冻切片,通过染色来观察次生细胞壁的发育情况,间苯三酚染色后,结果显示过表达株系的次生木质部发育程度要略高于野生型,但管腔变大;经荧光增白剂染色后,过表达株系的着色程度和范围都要明显高于野生型,且表皮和皮层中纤维素含量高于野生型,进一步表明过表达株系的纤维素高于野生型。结果说明:BpNAC5基因参与调控次生细胞壁的合成,并且对纤维素的合成呈现正调控。对过表达株系和野生型进行NaCl,ABA和Mannitol的胁迫实验。结果显示转基因株系的萌发率要高于野生型,DAB、NBT和Evans Blue的生理染色结果显示BpNAC5能够通过清除活性氧和减少细胞受损来提高转基因株系的抗逆能力。进行了 SOD、POD、MDA、相对电导率和叶绿素含量等生理指标的测定,对过表达株系OE5-1、OE5-2和野生型的抗逆性进行比较,结果也显示,在非生物胁迫下,BpNAC5过表达株系的抗逆能力要高于野生型,说明BpNAC5基因具有提高植物抗逆性的功能。通过酵母单杂交技术,筛选到了 ACGTATERD1、CGACGOSAMY3、DOFCOREZM、LTRECOREATCOR15、TAAAGSTKST1 等五个与 BpNAC5 基因互作的顺式作用元件,通过酵母单交杂和瞬时侵染烟草的方法对其进行了验证。利用PLACE网站对元件进行分析,结果表明白桦BpNAC5基因可能通过特异性识别这些元件来参与脱水响应、茎组织的碳代谢、低温诱导、气孔变化等过程。

关键词：白桦 BpNA C5 基因表达研究纤维素非生物胁迫酵母单杂交技术

粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32的转录调控因子的筛选与鉴定的初步研究

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粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32的转录调控因子的筛选与鉴定的初步研究

作者：陈菲菲南京师范大学

学位级别：硕士

本文主要研究是粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和L32-2的启动子及其转录调控因子,通过分子生物学和生物信息学的方法确定了启动子的范围,通过酵母单杂交的方法找到了一组启动子结合蛋白,该蛋白能分别与两个核糖体的启动子相互作用。本实... 详细信息

本文主要研究是粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和L32-2的启动子及其转录调控因子,通过分子生物学和生物信息学的方法确定了启动子的范围,通过酵母单杂交的方法找到了一组启动子结合蛋白,该蛋白能分别与两个核糖体的启动子相互作用。本实验室之前的实验通过不同实验的研究证明了RPL32-1和RPL32-2在细胞内存在不同功能,RPL32-1、RPL32-2在细胞处于不同生长状态下表达水平不同;当细胞进入沉默状态时RPL32-1高表达抑制细胞分裂;而细胞处于对数期时RPL32-2高表达则促进细胞分裂。因此,RPL32的同源基因的功能差异,进一步证明了重复的核糖体蛋白的同源基因在细胞内都存在不同的功能。核糖体蛋白是细胞翻译机制的重要组成部分,核糖体蛋白基因的转录和翻译效率直接影响着细胞翻译机制的功能。本论文在前期研究的基础上,对启动子和调控因子进行初步探索。首先通过分子生物学和生物信息学的方法分析两个核糖体蛋白的启动子序列特征。RPL32-1的启动子在转录起始位点上游200bp,其中,120bp到200bp处存在增强子序列。RPL32-2的启动子在转录起始位点上游1000bp,其中,900bp到1000bp处存在增强子。利用酵母单杂交技术,确定了一组启动子结合蛋白RPLX,并确定RPLX1与RPL32-2的启动子能够相互作用,而RPLX1与RPLX2和RPL32-1的启动子都能有相互作用。在之前的实验中还并未发现该核糖体蛋白有启动子结合蛋白的作用,后续实验可以进一步探究该蛋白与启动子的结合位点和调节作用。

关键词：粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL32 启动子启动子结合蛋白酵母单杂交技术