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基于酵母三杂交系统端粒酶抑制剂高通量筛选模型的建立

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基于酵母三杂交系统端粒酶抑制剂高通量筛选模型的建立

作者：王卫国南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景:端粒是真核生物染色体3′末端由富含G的DNA重复序列和端粒结合蛋白(telomere binding proteins,TBPS)组成的核蛋白复合物,就像鞋带末端的金属结一样,其功能主要是维护染色体稳定,防止染色体发生丢失、重排、末端融合和被酶消... 详细信息

研究背景:端粒是真核生物染色体3′末端由富含G的DNA重复序列和端粒结合蛋白(telomere binding proteins,TBPS)组成的核蛋白复合物,就像鞋带末端的金属结一样,其功能主要是维护染色体稳定,防止染色体发生丢失、重排、末端融合和被酶消化降解等。正常细胞复制时,由于DNA聚合酶不能完整复制线型的DNA末端,端粒在每次细胞分裂后将缩短50-100bp,当缩短到一定程度时,DNA变得不再稳定,双螺旋解开,细胞停止分裂,开始衰老或死亡,这就是正常细胞自身遗传程序决定的衰老和死亡的原因。而大多数恶性肿瘤细胞因为激活端粒酶(telomerase),能把端粒缩短的部分补上,细胞分裂后端粒并不缩短,这是肿瘤细胞永生化的重要前提条件,也使得端粒酶成为识别肿瘤细胞和正常细胞的重要标志之一。研究表明,90%以上的恶性肿瘤细胞都激活端粒酶,因此端粒酶成为肿瘤诊断和抗肿瘤药物设计的新靶点,以端粒酶作为抗肿瘤药物作用的靶标,建立肿瘤抑制剂筛选模型,在分子水平上筛选针对端粒酶的抑制剂,已成为寻找广谱抗肿瘤药物新途径。人的端粒酶由三个组分构成,端粒酶RNA(Telomerase RNA Component,TR)、端粒酶逆转录酶(Telomerase ReverseTransciptase,TERT)和端粒酶相关蛋白1(Telomerase associated protein,TEP1),端粒酶有活性的最小组成单位hTERT和hTR,重组端粒酶活性需要这两部分的正确组装。而hTERT和hTR的结合,就像酶和底物的结合,在细胞周期S期结合,表现出端粒酶活性,其它期又分开,这说明hTR-hTERT结合是可逆的,容易受抑制剂的影响。因此,如果筛选模型是针对hTR-hTERT的结合,就能大大提高筛选的特异性。由于hTR是RNA,降解快,体外难以操作,研究RNA-蛋白质相互作用的传统方法在一般的实验室不易于进行,而senGupta等的酵母RNA三杂交系统则巧妙地采取在细胞内合成RNA及研究RNA分子的策略,简单易行,而且提供了一个真核细胞体内环境,是用于研究蛋白质和RNA相互作用绝佳载体,在酵母三杂交系统中,其它的相互作用都是已知的,唯一可变的是我们需要研究的未知的蛋白质和RNA之间的相互作用,只要他们之间存在相互作用,就可用激活报告基因的转录,通过报告基因的表型特征来筛选阳性克隆。反过来,如果研究的RNA与蛋白的结合是已知的,如hTR-hTERT的结合,则该系统就可以用来研究导致hTR-hTERT解离的因素,或者作为筛选抑制hTR-hTERT结合的药物筛选模型,即当存在抑制两者结合的因素时(与hTR竞争结合hTERT的抑制剂),报告基因不表达。并且该系统可以配合高自动化点样技术,建立高通量的药物筛选模型。本课题组根据酵母RNA三杂交原理,首先找到hTR和hTERT之间相互作用的片段,然后利用这些特异的相互作用片段构建高通量特异性抑制hTR-hTERT结合的端粒酶抑制剂药物筛选模型的酵母,用于特异端粒酶抑制剂的筛选。目的: 1.分别构建能够表达不同hTR和hTERT片段的诱饵和猎物质粒。 2.利用酵母三杂交原理,将构建好的质粒共转化酵母,在酵母中研究hTR和hTERT结合的片段。 3.将存在相互作用的hTR和hTERT质粒共转染酵母,利用构建好的酵母配合高通量点样技术建立高通量酵母三杂交系统(Y3H)。方法和内容: 1.酵母表型检测及自激活性检测,使用缺陷混合氨基酸[色氨酸(Trp),尿嘧啶(Leu),组氨酸(His)]检测酵母菌株YBZ,L40 ura3营养需求。 2.不同诱饵载体的构建与转化:采用RT-PCR的方法从肿瘤细胞中扩增人端粒酶RNA(hTR)基因后,定点突变三个位点。分别扩增定点突变后的hTR基因假结合体区,CR4-CR5及H/ACA,CR7区hTR基因片段,纯化分离定向克隆到pRH3诱饵质粒,构建包含不同hTR目的基因片段的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定后,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性自激活检验。 3.不同猎物表达载体的构建及转化:采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中分别钓取含RID1、RID2、RT、C末端等区hTERT cDNA的片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3猎物质粒,构建包含不同hTERT目的基因片段的重组质粒,转化DH5α型大肠杆菌,筛选阳性克隆初步鉴定后,扩大培养,抽提质粒双酶切鉴定后进行DNA测序鉴定,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性自激活检验。 4.将不同的诱饵和猎物质粒按排列组合共转染酵母,用缺陷生长法对hTERT和hTR在酵母中的相互作用进行确认,将初步获得的存在相互作用诱饵和猎物阳性质粒重新转化酵母,通过缺陷生长实验,β-半乳糖苷酶活性检测,酵母菌落PCR等实

关键词：端粒酶端粒酶抑制剂人端粒酶RNA 人端粒酶催化亚基酵母三杂交高通量筛选

酵母三杂交技术的应用策略及在病毒研究中的应用

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国际病毒学杂志 2006年第2期13卷 37-41页

作者：段素素张云王树惠刘力中国医学科学院-中国协和医科大学基础医学研究所北京100005

从酵母双杂交系统衍生出来的酵母三杂交系统是一种主要用于研究细胞内RNA-蛋白质相互作用强大的技术方法,也为病毒相关研究,尤其为研究病毒生活史中病毒RNA与病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用提供了新的工具。本文重点介绍了此种形式... 详细信息

从酵母双杂交系统衍生出来的酵母三杂交系统是一种主要用于研究细胞内RNA-蛋白质相互作用强大的技术方法,也为病毒相关研究,尤其为研究病毒生活史中病毒RNA与病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用提供了新的工具。本文重点介绍了此种形式的酵母三杂交系统的原理、缺陷、应用和应用策略。另外,本文还介绍了同时发展起来的另外两种形式的酵母三杂交系统,即分别用于研究小分子配体-受体相互作用、复杂蛋白质相互作用的酵母三杂交系统。

关键词：酵母三杂交 RNA-蛋白质相互作用配体受体相互作用蛋白质相互作用

IQCE mRNA与FXR1P在酵母三杂交体系中的相互作用

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氨基酸和生物资源 2007年第3期29卷 26-29页

作者：马云何淑雅喻长顺苏娇张晋王茹静胡维新南华大学生命科学与技术学院生化与分子生物学教研室衡阳421001

脆性X相关基因1编码蛋白FXR1P是一种RNA结合蛋白,其所结合的靶RNA目前所知甚少。本研究应用酵母三杂交技术对本课题组从pRH3-cDNA人脑海马RNA表达文库中筛选到的一种可能与FXR1P存在相互作用的RNA IQCE进行研究,以验证该RNA与FXR1P的相... 详细信息

脆性X相关基因1编码蛋白FXR1P是一种RNA结合蛋白,其所结合的靶RNA目前所知甚少。本研究应用酵母三杂交技术对本课题组从pRH3-cDNA人脑海马RNA表达文库中筛选到的一种可能与FXR1P存在相互作用的RNA IQCE进行研究,以验证该RNA与FXR1P的相互作用。方法为:提取利用酵母三杂交技术初步筛选得到的酵母阳性克隆的质粒,转化大肠杆菌Top10,利用其质粒不相容性分离插入了目的片段的pRH3′-cDNA质粒,将该质粒转化入含目的基因FXR1的酵母菌株L40-ura3/pHyb lex/Zeo-MS2/pYESTrp3/FXR1,进行一对一的酵母三杂交验证,最后将该片段进行测序。测序结果为IQCE的一段编码序列,而目前尚无研究报导FXR1与IQCE的相互关系。结论:提示FXR1P与IQCE mRNA存在相互作用,IQCE可能是FXR1P发育调控网络组成成员之一。

关键词：酵母三杂交 FXR1P IQCE 脆性X综合征 RNA-蛋白质相互作用

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结构域酵母三杂交诱饵载体的构建及酵母转化

中国实用医药 2007年第22期2卷 1-3页

作者：马云李斌元徐向红刘慧婷贾瑜何淑雅南华大学生化与分子生物学研究所衡阳421001

目的脆性X相关蛋白(FXR1P)是一种RNA结合蛋白,本研究构建了其N-端结构域、KH结构域的酵母三杂交诱饵载体并转化酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2,为筛选这2种结构域的相互作用RNA作基础。方法根据Genebank提供的序列设计引物,以pYESTrp... 详细信息

目的脆性X相关蛋白(FXR1P)是一种RNA结合蛋白,本研究构建了其N-端结构域、KH结构域的酵母三杂交诱饵载体并转化酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2,为筛选这2种结构域的相互作用RNA作基础。方法根据Genebank提供的序列设计引物,以pYESTrp3/FXR1质粒作为模板,扩增分别包含FXR1P N-端结构域、KH结构域的编码区序列,连接到用于酵母三杂交文库筛选的pYESTrp3质粒,得到诱饵质粒,导入大肠杆菌Top10扩增,筛选阳性克隆并提取其中的重组质粒,再转化酵母菌L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2。结果经过测序验证,该重组诱饵质粒构建成功,转化酵母菌之后对宿主菌无毒性,无自激活现象。结论成功构建了能用于酵母三杂交文库筛选的FXR1P蛋白N-端结构域、KH结构域酵母三杂交诱饵载体,为研究这两个结构域的RNA结合功能奠定了基础。

关键词： FXR1P KH结构域 FXR1PN-端结构域酵母三杂交脆性X综合征

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酵母双杂交技术的应用及进展

安徽农业科学 2008年第19期36卷 8021-8022页

作者：刘骥张秀娟范建平张子义内蒙古农业大学生物工程学院内蒙古呼和浩特010018 内蒙古乌海市治沙站内蒙古乌海016000

酵母双杂交技术能有效检测蛋白与蛋白之间的作用,已成为检测蛋白重要手段之一。笔者在酵母双杂交技术的建立、工作原理、优点和局限性4个方面作了叙述,并介绍其进一步的发展及展望。

关键词：酵母双杂交技术蛋白之间的作用酵母单杂交酵母三杂交逆向双杂交系统

活细胞内筛选地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究

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癌症 2009年第3期28卷 255-261页

作者：郝坡王翀刘北忠孟凡萍王东生王春光刘畅金丹婷重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016 重庆三峡医药高等专科学校临床医学系重庆404020 重庆三峡中心医院临床检验科重庆404000

背景与目的:地塞米松衍生物(9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸)具有优于地塞米松的抗肿瘤活性,为探讨其抗肿瘤机制,本研究利用酵母三杂交技术在活细胞内筛选与之相互作用的靶蛋白。方法:构建诱饵质粒pGBKT7-GRα... 详细信息

背景与目的:地塞米松衍生物(9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸)具有优于地塞米松的抗肿瘤活性,为探讨其抗肿瘤机制,本研究利用酵母三杂交技术在活细胞内筛选与之相互作用的靶蛋白。方法:构建诱饵质粒pGBKT7-GRα-LBD,利用酵母三杂交技术从人K562细胞cDNA文库中筛选与地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白。结果:诱饵质粒成功构建,经Western blot分析可表达约31ku的诱饵蛋白,且诱饵蛋白没有毒性、渗漏和自激活现象。利用酵母三杂交技术从人K562细胞cDNA文库中筛选到37个能与地塞米松衍生物相互作用的蛋白质,并经酵母回转实验验证,得到20个真阳性克隆。结论:通过酵母三杂交技术在活细胞内筛选到20个与地塞米松衍生物有相互作用的蛋白。

关键词：白血病酵母三杂交地塞米松衍生物蛋白相互作用

高通量端粒酶抑制剂筛选模型融合表达载体的构建及转化

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中国现代医学杂志 2009年第13期19卷 1930-1933页

作者：王卫国曹莹张群张慧敏刘晓萍孔焕育庞建新吴曙光南方医科大学药学院新药评价中心广东广州510515

目的构建含不同结构域的人端粒酶逆转录酶(hTERT)酵母三杂交系统融合蛋白表达载体并转化酵母。方法采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中提取不同的hTERTcDNA片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3质粒,构建包含不同hTERT蛋白结构域的编码序列的重... 详细信息

目的构建含不同结构域的人端粒酶逆转录酶(hTERT)酵母三杂交系统融合蛋白表达载体并转化酵母。方法采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中提取不同的hTERTcDNA片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3质粒,构建包含不同hTERT蛋白结构域的编码序列的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性和自激活检验。结果经过测序验证,重组融合蛋白表达载体pYESTrp3-hTERT构建成功,转化酵母无毒性和自激活性。结论成功构建能用于酵母三杂交系统的融合蛋白表达载体,可于酵母三杂交系统筛选端粒酶抑制剂及hTERT和hTR间的相互作用。

关键词： hTERT 酵母三杂交端粒酶抑制剂

癫痫模型海马神经元细胞凋亡中caspase 3作用机理的初步研究

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癫痫模型海马神经元细胞凋亡中caspase 3作用机理的初步研究

作者：赵瑞第二军医大学

学位级别：硕士

癫痫是神经内、外科的常见病,我国的癫痫病人约有600万;估计每年新发病例接近40万。颞叶癫痫是癫痫中的常见类型,约占癫痫总数的20～30%,其中部分患者采用药物治疗无法控制发作,成为难治性癫痫,社会危害较大。颞叶癫痫患者常伴有海马... 详细信息

癫痫是神经内、外科的常见病,我国的癫痫病人约有600万;估计每年新发病例接近40万。颞叶癫痫是癫痫中的常见类型,约占癫痫总数的20～30%,其中部分患者采用药物治疗无法控制发作,成为难治性癫痫,社会危害较大。颞叶癫痫患者常伴有海马组织萎缩及由此引起的与学习记忆功能损害有关的一系列症状,其中海马萎缩主要由海马神经细胞丢失引起。较多的临床试验及动物模型研究均显示颞叶癫痫中海马神经细胞丢失以细胞凋亡为主,且caspase 3在该过程中发挥重要作用。Caspase 3在癫痫模型动物神经元凋亡过程中把ICAD酶切,从而导致DNA碎片的产生。细胞需要表达新基因及合成新蛋白质以完成凋亡过程,故考虑癫痫发作引发海马神经元凋亡的过程中可能有特异性的新基因及新蛋白质的表达,且其中可能有未曾发现的caspase 3的底物。真核生物起始因子2(Eukaryotic Translation Initiation Factor 2,eIF2)是一个调控真核细胞mRNA翻译起始的蛋白质,在翻译启动过程中起着关键作用。有作者报道在某些发生细胞凋亡的过程中发生eIF2的α亚基(eIF2α)被caspase 3酶切,酶切后eIF2调控翻译起始的能力降低。凋亡的进程可因不同组织、不同的病理生理条件而具有不同特点。在颞叶癫痫导致海马神经元凋亡中eIF2与caspase 3有无相互作用,其作用是否具有特殊性目前尚未见文献报道。本实验采用通用的海人藻酸癫痫模型,研究模型中caspase 3对其已知底物eIF2α的酶切及其与海马神经元凋亡的关系,并以酵母三杂交技术筛寻颞叶癫痫模型海马神经元细胞凋亡中caspase 3 的新底物,为进一步研究探讨caspase 3在颞叶癫痫病人海马神经元凋亡过程中的作用奠定基础。第一部分海人藻酸癫痫模型大鼠中Caspase 3对eIF2α作用的初步研究目的:对颞叶癫痫模型海马神经元凋亡中caspase 3对其已知底物eIF2α的酶切进行初步研究。方法:制备海人藻酸大鼠癫痫模型,观察记录其发作情况及脑电图表现,在发作终止后12、24、48、72、96h分别取海马组织,用TUNEL凋亡检测法检测模型大鼠海马神经元凋亡情况,用Western blot 法检测模型大鼠海马组织中eIF2α的表达变化,比较其与细胞凋亡之间的时程关系。结果:在癫痫发作后,随时间延长,海马神经元凋亡数量不断增加,在72小时达高峰,同时海马神经元中也出现了caspase 3酶切eIF2α产生的片段。结论:癫痫模型大鼠海马神经元中caspase 3 对eIF2α的酶切与海马神经元凋亡的发生时程一致,提示 caspase 3酶切eIF2α在癫痫模型大鼠海马神经元凋亡中可能发挥重要作用。第二部分从癫痫模型大鼠海马神经元中克隆caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1 目的:从癫痫模型大鼠海马的cDNA文库中筛寻caspase 3的新底物。方法:制作癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库;以PCR方法,从文库中克隆获得caspase 3及 eIF2α的全长cDNA,再以PCR方法获得caspase 3的 P12小亚基和酶切功能位点有点突变的P17大亚基,然后分别定向插入到pBridge质粒的两个MCS中,构建酵母三杂交诱饵载体,通过与eIF2α之间的一对一实验,检验该载体的有效性;以该载体对癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库进行酵母三杂交筛库。结果:成功建立了癫痫模型大鼠海马组织cDNA三杂交文库,构建了大鼠caspase 3基因的酵母三杂交诱饵载体,并通过caspase 3与eIF2α之间的相互作用验证,筛库获得caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1, 均具有Caspase 3的底物酶切位点的典型特征,且发现PIAS1与抑癌基因p53亦有相互作用。结论:用酵母三杂交系统寻找caspase 3下游底物具有可行性,从癫痫模型大鼠海马的cDNA文库中克隆获得caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1。已知MIZ1与细胞转录有关;PIAS1亦参与细胞凋亡,且可与p53作用诱导细胞凋亡。以上结果可促进对海马神经元凋亡过程的理解,具有深入研究价值,为进一步研究caspase 3在癫痫发作引起的海马神经元损伤中的作用机制奠定了基础。综上所述,本课题初步证明caspase 3对其底物的酶切在癫痫所致海马神经元丢失过程中有重要作用,并利用酵母三杂交技术对癫痫模型大鼠海马神经元凋亡进行研究,初步发现两个caspase 3的新底物,本研究结果将为探索在颞叶癫痫中caspase 3介导海马神经元凋亡的途径以及caspase 3可能参与的其他细胞学活动提供线索,为进一步研究颞叶癫痫海马神经元损伤机制及防治癫痫发作时神经元的损伤提供实验依据。

关键词：颞叶癫痫海马 caspase 3 eIF2α 酵母三杂交 PIAS1 MIZ1

细胞外RNA的初步克隆分析及miRNA-483前体相互作用蛋白的筛选

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细胞外RNA的初步克隆分析及miRNA-483前体相互作用蛋白的筛选

作者：焦虎平中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

RNA广泛存在于生命活动的各个过程，并在其中发挥着重要的功能。但是，人们对细胞外RNA(extracellular RNA，eRNA)还知之甚少。microRNA(miRNA)的发现使我们对基因表达调控有了一个全新的认识，但是miRNA前体的加工途径的精细过程还不... 详细信息

RNA广泛存在于生命活动的各个过程，并在其中发挥着重要的功能。但是，人们对细胞外RNA(extracellular RNA，eRNA)还知之甚少。microRNA(miRNA)的发现使我们对基因表达调控有了一个全新的认识，但是miRNA前体的加工途径的精细过程还不是很清楚。为了探索细胞外RNA的生物学功能，本研究以HepG2细胞为研究模型，通过RNA酶A的对细胞的离散作用及RNA抗体的细胞免疫荧光实验验证了细胞表面RNA分子的存在，研究了细胞培养液中RNA含量的变化。通过冻干法富集了细胞培养液中的RNA，并采用本室建立的RNA克隆方法对其进行了克隆。同时我们利用酵母三杂交技术筛选了本室克隆出的新的microRNA—48前体的相互作用蛋白。本研究取得的具体进展如下： 1．用RNA抗体细胞免疫荧光检测，证实了HepG2细胞表面存在RNA分子。 2．发现RNA酶A能使HepG2细胞离散，迁移能力增强，细胞表面伪足增加。 3．检测了HepG2细胞生长过程中培养液中和细胞表面RNA含量的变化。 4．建立了冻干浓缩提取细胞培养液中RNA的方法，并建立了细胞培养液RNA克隆方法，得到了若干条细胞培养液中的RNA，其中包括rRNA片段、人延伸因子1α亚单位、线粒体RNA片段和立克次氏体RNA，其中一条位于15号染色体CpG岛区的28nt的RNA与新发现的piRNA有很高的相似性。 5．用酵母三杂交技术得到了microRNA-483前体候选相互作用蛋白，其中C14OFR108和ZNF43得到了回转验证。 RNA在生命活动中的作用已经得到了人们的认可。细胞外RNA的研究也已经初见端倪，本研究以证实了细胞外RNA的存在，建立了细胞外液RNA的提取和克隆方法，获得了一些有特点的RNA;为细胞外RNA的研究建立了新的方法，。可以用于疾病的检测，同时为深入研究RNA在生命活动过程中的作用奠定了良好的基础。通过酵母三杂交技术筛选了与microRNA—483相互作用的蛋白质，为microRNA-483的加工机制研究提供了线索，同时为microRNA功能的研究提供了新的思路。

关键词：细胞外RNA RNA酶酵母三杂交微RNA