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番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因CpTAT的分离与分析

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热带作物学报 2016年第6期37卷 1141-1146页

作者：申艳红陈永萍杨菲颖鲁娜福建农林大学园艺学院园艺植物遗传育种研究所福建福州350002

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,... 详细信息

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,3′非编码区232 bp,开放性阅读框1 266 bp,编码421个氨基酸。序列分析表明,该基因为谷草转氨酶超家族成员,催化活性位点为第253位的赖氨酸,编码蛋白与毛果杨、野草莓、桃、拟南芥和水稻的TAT蛋白同源性分别为83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。荧光定量分析表明,Cp TAT基因在根中的表达量最高,在茎和果实中的表达较低,在叶中的表达量最低。与对照相比,外源乙烯处理能诱导番木瓜果实中Cp TAT基因表达量升高,而1-MCP处理则抑制了该基因表达,在果实衰老期表达量升高,该基因可能在番木瓜果实成熟衰老中起作用。

关键词：番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因克隆 RACE 维生素E

紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析

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中国农学通报 2012年第24期28卷 207-212页

作者：吕晓玲郝磊王芳黄晨天津科技大学天津300457 天津出入境检验检疫局天津300461

为获得紫苏迷迭香酸合成途径中的酪氨酸氨基转移酶基因,本研究采用同源克隆的方法,根据已报道的其他物种的TAT基因序列设计并合成简并引物,成功克隆得到了紫苏TAT基因片段(GenBank登录号:JN032113.1),该片段长为579bp,共编码193个氨基... 详细信息

为获得紫苏迷迭香酸合成途径中的酪氨酸氨基转移酶基因,本研究采用同源克隆的方法,根据已报道的其他物种的TAT基因序列设计并合成简并引物,成功克隆得到了紫苏TAT基因片段(GenBank登录号:JN032113.1),该片段长为579bp,共编码193个氨基酸残基,并命名为PfTAT。氨基酸序列比对分析发现其与彩叶草、丹参、拟南芥和罂粟的一致性分别为97%、94%、69%和58%,系统进化树分析表明PfTAT与唇形科植物的亲缘关系最近。采用半定量RT-PCR法分析PfTAT在紫苏的根、茎、叶中均有表达,且叶中的表达量较高,内源性植物激素信号分子对PfTAT表达量影响的实验表明,脱落酸、水杨酸处理均能够不同程度得上调PfTAT转录水平的表达。

关键词：紫苏迷迭香酸酪氨酸氨基转移酶基因克隆序列分析表达

水杨酸对丹参培养细胞中迷迭香酸生物合成及其相关酶的影响

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生物工程学报 2012年第3期28卷 320-328页

作者：焦蒙丽曹蓉蓉陈红艳郝文芳董娟娥西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

迷迭香酸(RA)是丹参中一种重要的酚酸类次生代谢物。为探讨水杨酸(SA)诱导子对丹参悬浮培养细胞中RA的生物合成及其相关酶的影响,考察了SA诱导子和酪氨酸氨基转移酶(TAT)的竞争性抑制剂(AOPP)对RA合成积累量、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和TAT... 详细信息

迷迭香酸(RA)是丹参中一种重要的酚酸类次生代谢物。为探讨水杨酸(SA)诱导子对丹参悬浮培养细胞中RA的生物合成及其相关酶的影响,考察了SA诱导子和酪氨酸氨基转移酶(TAT)的竞争性抑制剂(AOPP)对RA合成积累量、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和TAT活性的影响。发现在培养的第6天用浓度为6.25 mg/L的SA处理后,PAL活性在诱导后4 h出现高峰,为对照组水平的124%;RA的积累量在诱导后8 h出现峰值(5.914±0.296)mg/g。用浓度为0.1μmol/L的AOPP处理,6 h后AOPP对TAT活性影响较小(与对照组无显著差异),但明显抑制了PAL活性(为对照组水平的44%),且在PAL活性明显降低的同时RA的积累量显著减少(4.709±0.204)mg/g。进一步用0.1μmol/L AOPP和6.25 mg/L SA共处理,AOPP对PAL的抑制作用可得到一定程度的缓解,且RA的积累量较AOPP单独处理的高。表明SA可以诱导丹参悬浮培养细胞中RA积累量的增加,且在RA合成过程中PAL的限速作用比TAT明显。

关键词：丹参水杨酸迷迭香酸苯丙氨酸解氨酶酪氨酸氨基转移酶

Ca^(2+)对丹参培养细胞中迷迭香酸合成及其相关酶活性的影响

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生物工程学报 2012年第11期28卷 1359-1369页

作者：刘连成董娟娥张婧一党小琳行冰玉杨喜玲西北农林科技大学生命学院陕西杨凌712100 西北农林科技大学校医院陕西杨凌712100

探究了外界Ca2+(0~50 mmol/L)对丹参培养细胞迷迭香酸合成及其相关酶活性的影响,并利用细胞膜钙离子通道抑制剂异搏定(Verpamil,VP)及钙离子载体A23187初步探讨了外界Ca2+浓度变化影响丹参培养细胞次生代谢的机制。结果显示:培养6 d时... 详细信息

探究了外界Ca2+(0~50 mmol/L)对丹参培养细胞迷迭香酸合成及其相关酶活性的影响,并利用细胞膜钙离子通道抑制剂异搏定(Verpamil,VP)及钙离子载体A23187初步探讨了外界Ca2+浓度变化影响丹参培养细胞次生代谢的机制。结果显示:培养6 d时的丹参细胞中迷迭香酸积累量与外界Ca2+浓度显著相关,其中10 mmol/L Ca2+最有利于迷迭香酸的合成,迷迭香酸最大积累量达20.149 mg/g DW,比1 mmol/L和3 mmol/LCa2+处理分别高37.3%和20.4%。分析迷迭香酸合成的两条支路上的关键酶PAL和TAT活性变化发现,两种酶活性亦受外界Ca2+浓度影响,且活性变化先于迷迭香酸的积累,说明这两种酶均参与迷迭香酸的生物合成,但PAL比TAT促进作用更明显。进一步用VP和A23187处理发现,外界Ca2+影响迷迭香酸的合成是通过影响胞内Ca2+浓度实现的,胞外Ca2+内流可能参与了这一过程。

关键词：丹参迷迭香酸钙离子苯丙氨酸解氨酶酪氨酸氨基转移酶

茉莉酸甲酯对丹参培养细胞中迷迭香酸生物合成及相关酶活性的影响

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植物生理学报 2013年第12期49卷 1326-1332页

作者：行冰玉党小琳张婧一汪波陈子逸董娟娥西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

茉莉酸甲酯是植物细胞响应外界刺激产生的重要信号分子,与植物次生代谢物的生物合成有关。本研究考察了茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)对丹参培养细胞中迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)生物合成的影响。结果显示,10μmol·L-1的MeJA诱... 详细信息

茉莉酸甲酯是植物细胞响应外界刺激产生的重要信号分子,与植物次生代谢物的生物合成有关。本研究考察了茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)对丹参培养细胞中迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)生物合成的影响。结果显示,10μmol·L-1的MeJA诱导24 h后可显著提高丹参愈伤细胞中RA的积累量及其相关酶(PAL、TAT)的活性,在48 h时RA积累量和酶活性达到最大。布洛芬(IBU)处理可抑制MeJA对RA积累量和相关酶活性的促进作用,外源施加MeJA可部分解除IBU对RA合成及其相关酶活性的抑制作用。说明MeJA可以显著促进丹参培养细胞中RA的生物合成,IBU抑制了MeJA合成、PAL和TAT活性,从而导致了RA合成受阻。

关键词：丹参茉莉酸甲酯迷迭香酸苯丙氨酸解氨酶酪氨酸氨基转移酶

3-(4-羟基苯基)丙酸在酿酒酵母中的生物合成

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生物技术通报 2017年第9期33卷 184-190页

作者：江晶洁庄以彬殷华刘涛刘少伟华东理工大学上海200237 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶(Fj TAL)、拟南芥来源的对香... 详细信息

3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶(Fj TAL)、拟南芥来源的对香豆酰辅酶A连接酶(At4CL),同时利用酿酒酵母BY4742自身来源的超长链烯酰辅酶A还原酶(Sc TSC13)、硫酯水解酶,实现了在酿酒酵母中从头合成HPPA,产量约为70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸为前体、半乳糖诱导Fj TAL过表达、30℃发酵培养72 h的条件下,约36%的酪氨酸转化生成对香豆酸;在以4 mmol/L对香豆酸或咖啡酸为前体,半乳糖诱导At4CL过表达,同时利用酵母内源Sc TSC13、硫酯水解酶,30℃发酵培养72 h的条件下,约94%的对香豆酸被还原成HPPA,约91%的咖啡酸被还原成3,4-二羟基苯丙酸(DHPPA),为进一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基础。

关键词：酿酒酵母 3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA) 生物合成酪氨酸氨基转移酶对香豆酰辅酶A连接酶

丹参迷迭香酸代谢酪氨酸支路重要基因克隆及调控分析

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丹参迷迭香酸代谢酪氨酸支路重要基因克隆及调控分析

作者：易博第二军医大学

学位级别：硕士

迷迭香酸(Rosmarinic acid, RA)在植物中分布广泛,主要存在于唇形科和紫草科植物中,具有抗炎、抗菌、抗氧化等生理活性。对植物中迷迭香酸次生代谢途径研究表明,该代谢途径包括分别以苯丙氨酸和酪氨酸为前体的两条平行支路,各经过几步... 详细信息

迷迭香酸(Rosmarinic acid, RA)在植物中分布广泛,主要存在于唇形科和紫草科植物中,具有抗炎、抗菌、抗氧化等生理活性。对植物中迷迭香酸次生代谢途径研究表明,该代谢途径包括分别以苯丙氨酸和酪氨酸为前体的两条平行支路,各经过几步酶促反应生成4-香豆酰-Co-A和3,4-二羟基苯乳酸,二者在迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase, RAS)的作用下生成迷迭香酸。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为历代常用中药,根和根茎入药。从20世纪90年代以来,以迷迭香酸和丹参酚酸B为代表的水溶性活性成分成为研究的热点。然而迄今关于丹参中迷迭香酸次生代谢途径报道较少,使研究丹参迷迭香酸的次生代谢途径及调控和生物工程改良丹参种质资源存在瓶颈。本研究采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)和基因组步移(Genomic DNA walking)技术,首次从丹参植物中克隆得到迷迭香酸次生代谢途径酪氨酸支路上的三个相关基因:酪氨酸氨基转移酶基因(Tyrosine aminotransferase gene, SmTAT)、对羟基苯丙酮酸还原酶基因(4-hydroxyphenylpylpyruvate reductase gene, SmHPPR)和对羟基苯丙酮酸双氧化酶基因(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene, SmHPPD)的全长cDNA序列和基因组DNA序列。对各基因的研究如下: 1、SmTAT基因:根据其它物种中的TAT的基因序列,选择保守区域设计特异性引物克隆出丹参的SmTAT的cDNA全长序列及基因组DNA序列。cDNA序列全长1603 bp,包含一个完整的1233 bp的开放阅读框(Open reading frame, ORF),编码411个氨基酸残基。根据蛋白比对的结果,SmTAT基因编码的氨基酸序列与其它物种中报道的已知TAT蛋白序列具有高度的同源性。SmTAT基因组序列包含6个外显子和5个内含子,其启动子和终止子包含多个基因调控元件。该基因在丹参中为组成性表达,且茎中的表达比叶和根高。内源性植物激素信号分子及外界刺激,如甲基茉莉酸(Methyl jasmonic acid, MeJA)、脱落酸(Abscisic acid, ABA)、水杨酸(Salicylic acid, SA)和紫外照射(Ultraviolet-B radiation, UV-B)处理分别在一定程度上上调SmTAT转录水平的表达。 2、SmHPPR基因:对羟基苯丙酮酸还原酶(4-hydroxyphenylpylpyruvatereductase, HPPR)是迷迭香酸生物合成途径的第一个特异的关键酶。SmHPPR基因cDNA序列全长1066 bp,包含一个长度为939 bp,编码313个氨基酸残基的ORF。基因组DNA揭示含有2个外显子和1个内含子。SmHPPR基因编码的蛋白含有右旋-2-羟酸脱氢酶家族蛋白的两个典型结构域,与彩叶草中HPPR蛋白的一级、二级和三级结构均具有很高的相似性。SmHPPR启动子和终止子分析,含有多个基因调控元件。该基因在丹参根茎叶器官中为组成性表达,茎中最强,根次之,叶相对较弱。各种刺激考察显示MeJA, SA, ABA和赤霉素(Gibberellic acid, GA3)能上调SmHPPR转录表达水平,UV-B和双氧水(Hydrogen peroxide, H2O2)处理能下调其转录表达水平,提示该基因亦可能受茉莉酸、脱落酸、水杨酸及活性氧族信号调控途径的影响。 3、SmHPPD基因:对羟基苯丙酮酸双氧化酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD)与HPPR共有相同的催化底物,为迷迭香酸生物合成途径的一个旁路位点进入酶,催化对羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸,最终形成植物光合作用中电子传递所必需的质体醌和生育酚。根据其它物种中HPPD的基因序列,首次从丹参中克隆得到HPPD的cDNA全长序列及基因组DNA序列。cDNA序列全长1736 bp,包含一个完整的1443 bp的ORF,编码481个氨基酸残基。根据蛋白比对的结果,SmHPPD基因编码的氨基酸序列与其它物种中报道的已知HPPD蛋白序列具有高度的同源性。SmHPPD基因组序列包含2个外显子和1个内含子,其启动子和终止子包含多个基因调控元件。该基因在丹参中为组成性表达,且根和叶比茎中的表达高。UV-B、暗处理与自然光对照,结果显示,UV-B可抑制SmHPPD的转录表达。酪氨酸支路三个代谢基因的克隆与调控分析,为进一步明确阐述丹参中迷迭香酸的生物合成途径打下了坚实的基础,对

关键词：丹参迷迭香酸次生代谢 RACE 酪氨酸氨基转移酶对羟基苯丙酮酸还原酶对羟基苯丙酮酸双氧化酶基因序列分析信号途径刺激/应激

H2O2和NO参与水杨酸诱导丹参培养细胞中丹酚酸B生物合成的信号转导

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H2O2和NO参与水杨酸诱导丹参培养细胞中丹酚酸B生物合成的信号转导

作者：陈红艳西北农林科技大学

学位级别：硕士

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)为我国传统中药材，不仅具有通经活络、活血化瘀之功效，而且在治疗心肌梗塞及心绞痛等疾病方面发挥了重要作用。20世纪90年代以来，以丹酚酸B为代表的酚酸类化合物被认为是丹参发挥药效的物质基础而受到... 详细信息

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)为我国传统中药材，不仅具有通经活络、活血化瘀之功效，而且在治疗心肌梗塞及心绞痛等疾病方面发挥了重要作用。20世纪90年代以来，以丹酚酸B为代表的酚酸类化合物被认为是丹参发挥药效的物质基础而受到人们的广泛关注。利用生物技术手段，采用诱导子诱导植物细胞合成目标次生代谢产物，具有广阔的应用前景。丹参愈伤组织培养体系为通过非生物或生物诱导作用提高目标次生代谢产物含量提供了稳定可靠的技术平台。本研究以水杨酸(Salicylicacid,SA)为诱导子，结合多种抑制剂处理，对SA诱导丹参培养细胞合成丹酚酸B及其机理进行了探讨，取得了以下重要结论： ***诱导可提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B合成积累量、相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸氨基移转酶(TAT)活性。在适宜浓度(22mg/L)条件下，SA诱导处理2d后可使丹酚酸B大量积累。 ***是介导SA诱导丹参培养细胞丹酚酸B合成的信号分子。SA处理可有效诱导丹参培养细胞中HO产生、PAL和TAT活性升高，以及丹酚酸B合成积累量的增加;外源施加HO也可以有效促进PAL、TAT活性升高和SalB合成积累量的增加;HO的清除剂过氧化氢酶(CAT)对SA或外源HO诱导的SalB合成积累具有消除作用，HO淬灭剂-二甲基硫脲(DMTU)可以有效抑制SA对SalB合成的促进作用，质膜烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶抑制剂咪唑(IMD)可以抑制SalB的合成，但抑制效果可以部分被外源施加的SA所削弱，表明通过HADPH氧化酶产生的HO受阻或其他途径产生的HO被清除时，SA诱导的SalB合成积累也会受到抑制。以上结果说明，HO是介导SA诱导丹参培养细胞合成丹酚酸B的信号分子。 ***是介导SA诱导丹参培养细胞丹酚酸B合成的信号分子。SA可以有效诱导丹参培养细胞中NO产生、PAL活化及SalB合成积累。PAL专一性抑制剂(L-AOPP)可以有效抑制PAL活化及SalB合成积累，但不抑制NO释放;外源施加NO可以有效促进PAL活化及SalB合成积累量的增加，表明NO位于PAL活化及SalB生物合成的上游;NO淬灭剂(cPITO)可以有效抑制SA对SalB合成的促进作用，NO合成酶(NOS)抑制剂(L-NNA)可以抑制SalB的合成，但抑制作用可以被外源施加的SA削弱。上述结果表明，通过NOS产生的NO合成受阻时，SA诱导的SalB的合成也被抑制，说明NO是介导SA诱导丹参培养细胞中SalB合成积累的信号分子。 ***和NO均参与介导SA诱导丹参培养细胞丹酚酸B的生物合成。SA在诱导丹参培养细胞合成SalB过程中可以通过HO和NO彼此依赖或独立的信号转导途径，也可以通过不依赖于HO和NO的信号途径来诱导SalB的生物合成。

关键词：丹参水杨酸过氧化氢一氧化氮丹酚酸B 苯丙氨酸解氨酶酪氨酸氨基转移酶信号转导

茉莉酸甲酯对丹参酶活及酚酸化合物的含量和抗氧化活性影响

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茉莉酸甲酯对丹参酶活及酚酸化合物的含量和抗氧化活性影响

作者：李静四川农业大学

学位级别：硕士

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia Linn)多年生草本植物,其根及根茎入药,为《中国人民共和国药典》收载的中药丹参的唯一来源。四川省中江县是川丹参的道地产区,因其所产丹参色泽朱红、肉厚、次生代... 详细信息

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia Linn)多年生草本植物,其根及根茎入药,为《中国人民共和国药典》收载的中药丹参的唯一来源。四川省中江县是川丹参的道地产区,因其所产丹参色泽朱红、肉厚、次生代谢产量高而驰名海内外。本试验以四川省中江县丹参为研究对象,探讨了以茉莉酸甲酯(MJ)为诱导子对丹参抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD,过氧化物酶POD过氧化氢酶CAT)活性与酚酸类化合物合成途径密切相关的两种酶(苯丙氨酸解氨酶PAL和酪氨酸氨基转移酶TAT)活性影响以及对酚酸化合物含量、抗氧化能力的研究,为揭示MJ诱导子对丹参次生代谢物合成途径诱导机制提供理论基础,进而为以后利用MJ更好地调控次生代谢物的产量提供技术参数。取得了以下结论：1.通过试验MJ浓度越高,诱导SOD活性高峰出现时间越早;MJ诱导POD活性高峰：0.01mol/L-1mol/L出现在第3d,3mmol/L出现在第1d;诱导CAT活性高峰与浓度成负相关,MJ浓度越小CAT出现高峰越早,MJ浓度越高CAT出现高峰越晚。MJ诱导子诱导SOD、POD、CAT活性升高,但诱导效果和MJ的浓度诱导时间有关,具有差异性。2.在研究MJ诱导子对丹参次生代谢物合成积累的试验中,丹参酚酸类合成量增加趋势和PAL、TAT活性的变化趋势一致,酚酸化合物大量合成积累的同时伴随着PAL活性的显著增高,且与TAT的活性变化关系显著。以上结果说明,MJ是细胞合成酚酸化合物的有效诱导子,其诱导酚酸类物质大量合成的原因可能是活化了细胞中PAL、TAT的活性。3.较低浓度MJ调控丹参生成酚酸类物质的能力较强,0.01-0.5mol/L浓度范围的MJ均可在不同程度上诱导丹参酚酸含量的增加。MJ对丹参诱导第3d时,0.5mmol/L是最佳浓度,组培小叶酚酸含量最高为对照组的2.33倍;MJ对丹参诱导5d后,低浓度组(0.01-0.5mmol/L)的诱导效果显著高于高浓度组(1-3mmol/L),主要是由于高浓度的MJ刺激植物体产生过多的活性氧,超出了抗氧化酶的清除能力,对丹参细胞膜造成了严重的毒害。MJ可提高丹参酚酸化合物的合成积累量,但是合成积累量不会随着诱导子浓度递加而一直增加,出现一个最佳浓度。***处理后丹参各品系的DPPH自由基清除率与还原力增强,与对照相比差异极显著(P<0.01),说明MJ在试验中加强了丹参酚酸化合物的抗氧化能力。四品系丹参总还原力与DPPH的清除率效果一致,两种抗氧化能力强弱检测中都是组培小叶＞小叶丹参＞大叶丹参＞组培大叶,与VC (1mg/mL)对比只有组培小叶清除率高于VC,四品系的总还原力都高于VC,组培小叶、小叶丹参、大叶丹参、组培大叶分别为VC的1.32倍、1.31倍、1.23倍、1.22倍。

关键词：茉莉酸甲酯超氧化物歧化酶过氧化物酶过氧化氢酶苯丙氨酸裂解酶酪氨酸氨基转移酶酚酸化合物抗氧化活性