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CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹免疫功能调节作用的研究

CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹免疫功能调节作用的研究

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作者：李红霞苏州大学

学位级别：硕士

CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)，是人工合成的能够模拟细菌DNA的免疫刺激活性的含有CpG基序的ODN，大量研究表明，它们能激活人类、哺乳类及鱼类等动物的免疫系统，是一类良好的非特异性免疫增强剂与特异性免疫... 详细信息

CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)，是人工合成的能够模拟细菌DNA的免疫刺激活性的含有CpG基序的ODN，大量研究表明，它们能激活人类、哺乳类及鱼类等动物的免疫系统，是一类良好的非特异性免疫增强剂与特异性免疫佐剂。但是，迄今为止，尚未见有关CpG ODNs对中华绒螯蟹免疫功能影响及其作用机理的研究报道。为探讨CpG ODNs对中华绒螯蟹蟹免疫功能及抗病力的影响，进行试验一。将ODN-1670(含1个CpG基序)和ODN-R(含1个反向CpG基序，即GpC)按1、5、25μg／kg体重的剂量体腔注射中华绒螯蟹，在注射之前(0d)和注射后第1、3、5、8d采样，同时以注射0.1mL生理盐水组与未进行任何处理的空白组作为对照，进行一系列免疫学指标的测定;并在第二次采样(第3d)时，从每个处理组中取蟹6只，以1.2×10～7cfu／kg体重的剂量体腔注射蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株，记录接种7d后各组蟹的累积死亡率。结果显示，注射适量的ODN-1670能显著地增加中华绒螯蟹的血细胞总量(THC)、透明细胞(HC)、小颗粒细胞(SGC)和颗粒细胞(GC)数量，显著地增强血细胞的吞噬活性和呼吸爆发活性，显著地增强血清酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、溶菌酶(LSZ)、溶血素(Hemocytin)及抗菌活性(Ua)(P＜0.05)。此外，本试验条件下，ODN-1670还能明显提高中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抗感染能力。与此同时，试验剂量的ODN-R除能使血清酚氧化酶活性显著增加(P＜0.05)外，对其他免疫指标的影响均不显著。本试验表明，适量的ODN-1670能增强中华绒螯蟹的免疫功能和抗病力，是适合中华绒螯蟹的新型潜在免疫增强剂，可进一步加以研发和利用。为初步探讨CpG ODN激活中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原(proPO)激活系统的信号转导途径，进行试验二。用适量的CpG ODN和几种细胞信号转导的激活剂或抑制剂处理M-199培养的离体中华绒螯蟹血细胞，通过检测血细胞胞内外酚氧化酶(PO)的增减情况，对CpG ODN触发proPO激活系统的信号转导途径进行评价。结果表明，本次试验所选ODN-1670与ODN-R均可触发蟹血细胞proPO激活系统。两者的信号转导途径相似，有可能都包含了G-蛋白介导的蛋白激酶C(PKC)途径，酪氨酸蛋白激酶(RTK)途径对ODN-1670的触发proPO激活系统的活化过程进行负调控。而依赖于cAMP的蛋白激酶A(PKA)途径可能不参与两种ODN诱导的proPO系统的活化过程。

关键词：中华绒螯蟹 CpG ODN 先天性免疫抗病力酚氧化酶原激活系统信号转导

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两种植物多糖的提取及对中华绒螯蟹免疫功能影响的研究

两种植物多糖的提取及对中华绒螯蟹免疫功能影响的研究

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作者：陈星苏州大学

学位级别：硕士

以米糠和山药为材料，采用热水浸提法，通过单因素和L(3)正交试验，研究了乙醇浓度、提取时间、水料比和提取温度对米糠和山药多糖得率的影响。结果表明，米糠多糖最佳提取工艺为：乙醇浓度95％、提取时间5 h、水料比20：1、提取温度110... 详细信息

以米糠和山药为材料，采用热水浸提法，通过单因素和L(3)正交试验，研究了乙醇浓度、提取时间、水料比和提取温度对米糠和山药多糖得率的影响。结果表明，米糠多糖最佳提取工艺为：乙醇浓度95％、提取时间5 h、水料比20：1、提取温度110℃;山药多糖最佳提取工艺为：乙醇浓度95％、提取时间3 h、水料比15：1、提取温度100℃。在此基础上，研究了微波辅助对两种多糖得率的影响，结果发现，米糠和山药经650W微波功率在中火力条件下预处理4 min，再按热水浸提的最佳工艺进行提取，两种多糖的得率均明显提高，分别达到1.33％和2.48％，明显优于常规热水浸提法的0.920％和2.025％。将实验室自制的两种植物多糖—米糠多糖(含量77.8％)和山药多糖(含量71.6％)以10 mg／kg和20 mg／kg体重的剂量体腔注射中华绒螯蟹，以生理盐水注射和不作任何注射的蟹为对照，在注射多糖后的第1、3、5、8 d采样，对血细胞总量(THC)、不同类型的血细胞数量(DHC)，血细胞的吞噬活性、呼吸爆发活性(O产量)，血细胞破碎物上清液(HLS)的总酚氧化酶(PO)、血清酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物岐化酶(SOD)、酸／碱性磷酸酶(ACP／ALP)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、溶血素(Hemocytin)及抗菌活性(Ua)进行测定;并在注射多糖后的第3d，从每个处理组中取蟹6只，以1.2×10 cfu／kg体重的剂量体腔注射蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株，记录接种7 d后各组蟹的累积死亡率。结果显示，两种多糖均能明显增强中华绒螯蟹的免疫功能和对嗜水气单胞菌的抗感染能力，而且低剂量组的效果优于高剂量组，表明两种多糖可能都属于双向免疫调节剂。本课题还初步研究了两种植物多糖激活中华绒螯蟹血细胞proPO系统的信号传导途径。用适量的多糖和几种细胞信号转导的激活剂或抑制剂处理M-199培养的离体中华绒螯蟹血细胞一定时间，通过检测血细胞胞内外酚氧化酶(PO)的增减情况，对多糖触发proPO激活系统的信号传导途径进行评价。结果表明，两种多糖触发中华绒螯蟹血细胞proPO系统的信号传导途径相似，均可能是经过PKC而非PKA途径进行信号转导，进而促进proPO颗粒的释放、转化与合成，并通过酪氨酸蛋白激酶途径进行负调控。

关键词：中华绒螯蟹植物多糖免疫酚氧化酶原激活系统信号转导

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基于黄粉虫的细菌检测条件的建立与优化

基于黄粉虫的细菌检测条件的建立与优化

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作者：李晓燕沈阳药科大学

学位级别：硕士

酚氧化酶原激活系统是昆虫体内重要的先天性免疫机制之一。本实验以黄粉虫为实验模型,建立并优化了细菌诱导的黄粉虫血淋巴中酚氧化酶原的激活及酚氧化酶活力测定条件。以肽聚糖作为诱导因子,采用正交实验考察温度、pH、激活剂、预反应... 详细信息

酚氧化酶原激活系统是昆虫体内重要的先天性免疫机制之一。本实验以黄粉虫为实验模型,建立并优化了细菌诱导的黄粉虫血淋巴中酚氧化酶原的激活及酚氧化酶活力测定条件。以肽聚糖作为诱导因子,采用正交实验考察温度、pH、激活剂、预反应时间等因素的影响,建立体外血淋巴酚氧化酶原激活及活性测定的最佳条件如下：反应温度30℃,激活剂加入量5μl,反应pH值为8,预反应时间5分钟,其中温度和反应pH值对检测结果影响显著。大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)完整菌株可体外激活血淋巴酚氧化酶原激活系统,但所需浓度较高、检测时间较长、灵敏度较低。选用以上菌株经物理学、生物学、化学方法处理后检测其对酚氧化酶原激活系统的影响情况,筛选其最佳处理方法为优化的化学方法。利用最佳方法处理后的十种菌株中有八种菌株在菌落数为101数量级范围内,利用血淋巴酚氧化酶原激活系统可稳定检出,定量分析结果显示,不同种类的菌株,存在着反应出现时间,反应灵敏度,反应现象显著性等方面的差异。

关键词：黄粉虫酚氧化酶原激活系统细菌检测

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昆虫ALP蛋白的免疫识别作用研究

昆虫ALP蛋白的免疫识别作用研究

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第九届全国免疫学学术大会

作者：文代华曹娜静张景海张嵘沈阳药科大学

昆虫应对病原微生物入侵时的先天性免疫应答主要经由模式识别、信号转导与调制、产生效应分子三个主要步骤而实现。模式识别通过病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP)以及模式识别受体(Pattern recognition ... 详细信息

昆虫应对病原微生物入侵时的先天性免疫应答主要经由模式识别、信号转导与调制、产生效应分子三个主要步骤而实现。模式识别通过病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP)以及模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)二者的相互作用产生,是机体启动免疫应答的首要因素。已报道的PRRs如PGRP、GNBP、CTL等,一般识别与之对应的某一种特定PAMP。ALP蛋白在不同物种中具有高度相似的空间结构,有报道指出,ALP蛋白具有免疫学功能。本文以家蚕(Bombyx mori)与柞蚕(Antheraea pemyi)为研究对象,对ALP蛋白的模式识别受体功能以及ALP蛋白下游的信号转导通路及调控机制进行研究。采用柱层析技术及分子生物学方法获得天然及重组ALP蛋白并制备多克隆抗体,考察ALP蛋白与不同PAMP的结合能力,以及对酚氧化酶原(pro-phenoloxidase,pPO)系统的激活能力。Western blot结果显示,ALP蛋白能够特异性地与不溶性β-1,3 glucan,DAP-PGN和Lys-PGN结合;进一步的ELISA结果显示,ALP蛋白亦能够结合可溶性的LPS,LTA,β-1,3 glucan,DAP-PGN,Lys-PGN和Mannose。PO活力测定显示ALP蛋白与上述6种PAMPs结合后,均使PO活力上调。综上,昆虫ALP蛋白具有广谱的模式识别受体特性,并参与激活pPO系统。

关键词：模式识别酚氧化酶原激活系统先天性免疫

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柞蚕βGRP识别机制的研究

柞蚕βGRP识别机制的研究

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第九届全国免疫学学术大会

作者：王夏璐李小盼张嵘沈阳药科大学

在先天性免疫系统中,不同的模式识别蛋白(Pattern recognition proteins,PRPs)对不同的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular paaems,PAMPs)/病原菌具有普遍或特异性识别作用,是启动先天性免疫系统进而产生信号传导的"开门... 详细信息

在先天性免疫系统中,不同的模式识别蛋白(Pattern recognition proteins,PRPs)对不同的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular paaems,PAMPs)/病原菌具有普遍或特异性识别作用,是启动先天性免疫系统进而产生信号传导的"开门砖",并最终产生有效的防御反应。其中,特异性识别真菌特有PAMP—1,3-β-D-葡聚糖的PRR称为1,3-β-D-葡聚糖识别蛋白(1,3-β-D-glucan recognition protein,pGRPs),是昆虫先天性免疫系统中最重要的PRRs之一。目前,虽然已经获得多种昆虫βGRPs,并明确其模式识别功能,但识别机制尚不清楚。本文在柞蚕天然βGRP识别功能研究的基础上,利用基因工程手段,对其两个结构域(N和C端结构域)的生物学功能进行研究,解析柞蚕βGRP识别PAMPs的分子机制并研究其识别后对柞蚕先天性免疫系统的影响。构建大肠杆菌表达体系BL21/pET-28a(+)-βGRPN和BL21/pET-28a(+)-βGRPC,经诱导表达、分离纯化获得13 kDa柞蚕βGRPN端结构域—βGRPN和45kDaβGRPc端结构域—βGRPC。Western blot和ELISA实验结果表明,与柞蚕天然βGRP相似,βGRPC对PAMPs行使识别功能,且对1,3-β-D-葡聚糖识别能力最强;PO活力实验结果显示,其在识别后参与激活酚氧化酶原激活系统,激活能力与识别能力成正比;βGRPN对包括1,3-β-D-葡聚糖在内的多种PAMP均无识别作用。这一研究,不仅为阐述βGRP模式识别的分子机制提供了理论依据,同时为深入了解先天性免疫相关蛋白的结构与功能关系奠定必要的基础。

关键词：先天性免疫 1,3-β-D-葡聚糖识别蛋白结构域酚氧化酶原激活系统

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柞蚕酚氧化酶原cDNA序列的获得、重组表达及功能研究

柞蚕酚氧化酶原cDNA序列的获得、重组表达及功能研究

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第九届全国免疫学学术大会

作者：王夏璐郝淋淋张嵘沈阳药科大学

酚氧化酶原激活系统是昆虫先天性免疫系统中最重要的体液免疫反应之一。酚氧化酶(phenoloxidase,PO)作为该系统的效应酶,能催化形成黑色素,杀死入侵物质,从而起到免疫防御的作用。目前有关PO的研究主要集中在果蝇、斑节虾等生物,对鳞翅... 详细信息

酚氧化酶原激活系统是昆虫先天性免疫系统中最重要的体液免疫反应之一。酚氧化酶(phenoloxidase,PO)作为该系统的效应酶,能催化形成黑色素,杀死入侵物质,从而起到免疫防御的作用。目前有关PO的研究主要集中在果蝇、斑节虾等生物,对鳞翅目昆虫了解甚少。本文以具有自身免疫特色的中国特有昆虫——柞蚕(Antheraea pernyi)为对象,对其体内的酚氧化酶原(pro phenoloxidase,pPO)进行基因克隆和生物学功能的研究。利用PCR及RACE等分子生物学方法首次获得柞蚕pPO(Ap-pPO)cDNA序列2322bp(Genbank:KJ803014),其中开放阅读框包含2049bp,编码683个氨基酸残基。经预测,Ap-pPO分子量约为78.3kDa,等电点为6.46,无信号肽及糖基化位点。构建大肠杆菌表达体系BL21/pET-28a(+)-Ap-pPO,经分离纯化获得重组Ap-pPO。Western Blot和PO活力测定结果显示,重组pPO不能被SDS,CPC,甲醇,异丙醇非特异性激活剂所激活,能被微量激活的柞蚕血淋巴切割成有活性的形式。经酶学性质研究发现,Ap-pPO的最适pH和最适温度分别为7.8和40℃,且pH值对PO的活力影响较大;PO的特异性底物为焦性没食子酸(Km值为1.81mmol/L)。综上,对Ap-pPO的研究不仅为揭示酚氧化酶原激活系统的激活机制提供物质基础,同时也为昆虫先天性免疫响应的生物多样性提供了理论证据。

关键词：酚氧化酶原激活系统酚氧化酶原柞蚕先天性免疫

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