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MiR-378b对酒精性肝病脂质代谢的影响

MiR-378b对酒精性肝病脂质代谢的影响

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作者：王迎朝桂林医学院

学位级别：硕士

目的:在世界范围内,酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)是疾病发病和死亡的主要原因之一,但是ALD的发病机制尚待研究。最近的研究强调了mi RNA在调节肝脏脂质代谢中的作用。然而,目前有关mi R-378b在肝脂代谢中的生物学功能的信... 详细信息

目的:在世界范围内,酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)是疾病发病和死亡的主要原因之一,但是ALD的发病机制尚待研究。最近的研究强调了mi RNA在调节肝脏脂质代谢中的作用。然而,目前有关mi R-378b在肝脂代谢中的生物学功能的信息有限。本研究的目的旨在阐明mi R-378b在酒精诱导的肝脏脂堆积中的作用及其潜在机制。方法:本实验采用200 m M乙醇诱导L-02细胞48 h建立酒精肝细胞模型后,使用Q-PCR检测L-02细胞模型中mi R-378b的表达。为了进一步探究mi R-378b是否参与调节酒精所致肝脂质蓄积,采用生物信息学方法预测mi R-378b的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验和western blot验证。Mi R-378b mimics和mi R-378binhibitor通过电穿孔法转入L-02细胞,转染12 h后换成含200 m M乙醇的培养基培养48 h,采用试剂盒检测细胞中甘油三酯和胆固醇水平。C57BL/6J小鼠喂食含有5%(w/v)乙醇的Lieber-De Carli液体饮食4周来建立酒精性肝小鼠模型。Q-PCR检测小鼠肝脏中mi R-378b的表达。将过表达和沉默mi R-378b腺相关病毒载体通过尾静脉注入小鼠体内来构建体内过表达和沉默mi R-378b小鼠模型。H&E染色法来确定小鼠肝组织病变程度和脂质累积情况;采用商业试剂盒和全自动生化分析仪检测小鼠血清和肝脏中胆固醇和甘油三脂水平;采用PCR和western blot检测L-02细胞和小鼠肝脏中脂质代谢中相关因子的表达水平。结果:结果表明乙醇诱导L-02细胞中mi R-378b高表达,生物信息学及双荧光素酶报告基因结果表明Ca MKK2是mi R-378b的直接靶标。并且转染mi R-378b mimics后,L-02细胞中mi R-378b表达增高,TG、TC累积增多,而转染mi R-378b inhibitor质粒部分逆转了酒精对L-02细胞的诱导作用。小鼠体内过表达mi R-378b后,小鼠肝脏中mi R-378b表达升高,小鼠血清和肝脏中TG、TC水平升高,小鼠肝脏病理学损伤进一步加重,而体内低表达mi R-378b部分逆转了酒精对小鼠的诱导作用。不管是在L-02还是在小鼠肝脏中,mi R-378b都能够影响脂质代谢相关途径传导,过表达mi R-378b会使Ca MKK2、p-AMPK/AMPK、CPT1α、PPARα蛋白表达水平显著降低,p-ACC/ACC、SREBP1c、FASN蛋白表达水平显著升高。而沉默mi R-378b部分逆转了乙醇对小鼠肝脏脂质代谢相关信号通路的影响。结论:在乙醇诱导的L-02细胞和C57BL/6J小鼠酒精性肝病模型中,mi R-378b可以通过靶向Ca MKK2来调节肝脏脂质代谢,可能成为ALD治疗的潜在靶点。

关键词： miR-378b 酒精性肝脂肪变性 CaMKK2 脂质代谢 AMPK级联

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茵陈篙中去乙酰氧母菊素基于P2x7受体调控巨噬细胞的炎症反应和酒精暴露肝细胞的脂质蓄积的机制

茵陈篙中去乙酰氧母菊素基于P2x7受体调控巨噬细胞的炎症反应和酒...

引用

作者：尚月延边大学

学位级别：硕士

目的:去乙酰氧母菊素(leucodin)是一种倍半萜内酯,分离于茵陈蒿的地上部分。研究发现茵陈蒿具有一定的抗炎和保肝活性,但仍未确定来自茵陈蒿的生物活性成分leucodin是否能改善乙醇诱导的肝细胞损伤并伴有炎症。本研究采用了脂多糖(lipop... 详细信息

目的:去乙酰氧母菊素(leucodin)是一种倍半萜内酯,分离于茵陈蒿的地上部分。研究发现茵陈蒿具有一定的抗炎和保肝活性,但仍未确定来自茵陈蒿的生物活性成分leucodin是否能改善乙醇诱导的肝细胞损伤并伴有炎症。本研究采用了脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)联合刺激几种类型的巨噬细胞,以及肝细胞暴露于乙醇的模型,以研究leucodin如何通过嘌呤受体P2X配体门控性离子通道7(purinergic receptor P2Xligand-gated ion channel 7,P2X7R)途径抑制巨噬细胞中的炎症反应,并减轻乙醇诱导的肝细胞中的脂质蓄积。方法:采用小鼠腹腔巨噬细胞,小鼠骨髓来源的巨噬细胞和人巨噬细胞THP-1细胞等若干种类巨噬细胞,用不同浓度leucodin(1μM和5μM)预处理1小时,然后用LPS和ATP刺激。通过蛋白印迹分析IL-1β、P2x7R和NLRP3的蛋白表达水平。将对数生长期的HepG2细胞暴露于乙醇以诱导脂质沉积。在此之前用不同浓度的leucodin(1μM和5μM)预处理对数生长期HepG2细胞。油红O染色实验分析HepG2细胞形态学变化,并观察脂质合成相关的重要因子胆固醇调节元件结合蛋白-l(Sterol Regulatory Element-binding Protein-1,SREBP1)免疫荧光染色的荧光强度变化;通过蛋白印迹检测AMP依赖的蛋白激酶α(AMP-activated Kinaseα,AMPKα)、P-AMPK、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)、P-ACC的蛋白表达用于确定leucodin是否抑制HepG2细胞中的脂质沉积。并进行leucodin的毒性检验,利用体外MTT分析检测小鼠腹膜巨噬细胞的生存率。基于Griess反应测量培养基中积累的亚硝酸盐作为NO产生的指标。结果:LPS加ATP在小鼠腹膜巨噬细胞中启动IL-1β裂解和释放,并在4小时达到峰值。Leucodin在200μM内没有显示出显著的毒性,并且有效抑制了巨噬细胞中pro-IL-1β的裂解和成熟IL-1β的释放。此外,P2x7R拮抗剂和胱天蛋白酶-1抑制剂也降低了 IL-1β的释放和切割。另外,leucodin抑制LPS/ATP刺激的巨噬细胞中的 P2x7R,Toll 样受体-4(Toll Like Receptor-4,TLR4)和 Nod 样受体蛋白 3(NOD-like Receptor Pyrin Domain Containing 3,NLRP3)表达。用不同浓度的leucodin预处理HepG2细胞1小时,然后暴露于乙醇中24小时。Leucodin抑制脂质蓄积并增强暴露于乙醇的HepG2细胞中AMPK和ACC的磷酸化。此外,leucodin抑制乙醇处理的HepG2细胞中甾醇调节元件结合蛋白-1(Sterol Regulatory Element-binding Protein-1,SREBP1)和 ACC 的表达。结论:Leucodin具有抑制巨噬细胞炎症反应和抑制肝细胞脂质蓄积的能力,这表明有针对性的治疗潜力,针对酒精性肝病的炎症和脂质代谢。

关键词：去乙酰氧母菊素酒精性肝脂肪变性炎症 P2x7R NLRP3

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