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配体结合对G蛋白力学性能影响的研究

配体结合对G蛋白力学性能影响的研究

作者：赵树鑫燕山大学

学位级别：硕士

蛋白质的机械稳定性在细胞粘附、肌肉收缩等众多生命过程研究中扮演着重要的角色,如何对蛋白质的机械性能进行有效调控是结构生物学领域有待解决的重要问题。目前,对蛋白质机械稳定性进行调控的主要手段是直接调节蛋白质结构中的抗力部... 详细信息

蛋白质的机械稳定性在细胞粘附、肌肉收缩等众多生命过程研究中扮演着重要的角色,如何对蛋白质的机械性能进行有效调控是结构生物学领域有待解决的重要问题。目前,对蛋白质机械稳定性进行调控的主要手段是直接调节蛋白质结构中的抗力部位,从而达到对蛋白质机械性能的调控。近期有研究小组利用原子力显微镜实验发现了一个有趣的现象,即人类免疫球蛋白的Fc片段(hFc)不是直接作用于抗力部位,而是通过一种长程变构效应达到对GB1蛋白质机械性能的调控,然而这种长程调节蛋白质机械稳定性的内部机制并不清楚。本论文采用拉伸分子动力学(SMD)模拟方法,研究了GB1蛋白结合hFc前后力学性能的变化,在此基础上提出了hFc对GB1力学性能的调控机制。主要内容如下:首先,我们利用恒速SMD(cv-SMD)模拟以及恒力SMD(cf-SMD)模拟分别研究了GB1蛋白结合hFc前后的受力去折叠过程以及去折叠力的大小,探讨了配体结合对GB1蛋白的机械稳定性的影响情况。其次,基于GB1单体蛋白和GB1-hFc复合物的SMD模拟轨迹,我们对两个体系中β1-β4、β1-β2和β3-β4之间的氢键断裂情况进行了分析,成功找到了GB1蛋白结构中的抗力部位,并且研究表明,hFc配体的结合并不改变体系的抗力部位。最后,我们分析了GB1蛋白的抗力部位和配体结合部位在外力作用下的形变情况,在此基础上,提出了配体结合对GB1蛋白机械稳定性的长程调控机制。我们发现拉伸外力在引起蛋白质抗力部位发生形变的同时也会导致结合部位发生形变,也就是说这两个部位存在一种长程耦合关系,当配体hFc结合时,它能够有效限制结合位点的形变,从而导致GB1蛋白的抗力部位形变减弱,进而提升GB1蛋白的力学性能。我们的研究不仅在原子层面上提供了GB1蛋白去折叠过程,并且解释了配体hFc结合对GB1蛋白机械稳定性影响的机制。

关键词：配体结合 G蛋白机械稳定性拉伸动力学模拟变构效应

甜菜夜蛾触角结合蛋白Ⅱ的cDNA克隆、组织分布及配体结合特性分析

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昆虫学报 2012年第5期55卷 499-509页

作者：张婷刘乃勇董双林南京农业大学植物保护学院农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室南京210095

触角结合蛋白(antennal binding proteins,ABPs)是气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的一个亚类,推测其在昆虫嗅觉中起作用。为了探讨这一问题,本研究通过转录组数据分析并利用RACE技术,克隆了甜菜夜蛾Spodoptera exigua触... 详细信息

触角结合蛋白(antennal binding proteins,ABPs)是气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的一个亚类,推测其在昆虫嗅觉中起作用。为了探讨这一问题,本研究通过转录组数据分析并利用RACE技术,克隆了甜菜夜蛾Spodoptera exigua触角结合蛋白Ⅱ基因(SexigABP2)的全长cDNA序列(GenBank登录号为HQ234486)。序列分析表明,该基因开放阅读框长444bp,编码148个氨基酸,具有OBPs典型的6个半胱氨酸位点;其氨基酸序列和烟芽夜蛾Heliothisvirescens的HvirABP2的一致性最高,达72%。实时定量PCR分析显示,该基因主要在触角中表达,在喙、足、翅等组织中也有少量表达,且在雌蛾触角及足中的表达量显著高于雄蛾。进一步对该基因进行原核表达和纯化,利用荧光竞争结合实验测定了SexigABP2对35种气味物质的结合能力,发现其对甜菜夜蛾性信息素组分(Z)-9-十四碳烯醇和植物挥发物法尼醇的结合能力较强,结合常数分别为8.24μmol/L和8.14μmol/L。结合能力比较表明,SexigABP2对不饱和长碳链化合物较饱和短碳链化合物具有更强的结合能力;在不饱和长碳链化合物中,对醇类物质又较乙酸酯类物质具有更强的结合能力。结果提示SexigABP2可能参与了成虫对不饱和长碳链的植物挥发物的感受。

关键词：甜菜夜蛾触角结合蛋白基因克隆组织表达谱配体结合荧光竞争结合实验

人干扰素α2b ELISA配体结合分析检测方法的建立

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中国免疫学杂志 2023年第6期39卷 1312-1317页

作者：代晓阳张燕沈丽红解翠薇杨晓春翁勤洁(指导) 浙江大学药物安全评价研究中心杭州310000

目的:建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b定量ELISA检测法,用于药物研发检测。方法:采用双抗夹心法建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b含量检测方法,确定其检测范围,验证其选择性、精密度与准确度和稀释线性,并对样本稳定性... 详细信息

目的:建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b定量ELISA检测法,用于药物研发检测。方法:采用双抗夹心法建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b含量检测方法,确定其检测范围,验证其选择性、精密度与准确度和稀释线性,并对样本稳定性进行研究。结果:建立的方法检测范围为0.50~16.00 ng/ml。选择性结果显示不同个体来源空白金黄地鼠组血浆和组织匀浆无差异,血浆质控样本准确度为78.62%~104.69%,批内精密度为0.69%~18.21%,批间精密度为6.71%~15.81%,总误差均配体结合的人干扰素α2b ELISA检测法,该方法灵敏度高,重复性好,检测效率高,为新药研发提供了可靠的检测方法。

关键词：重组人干扰素α2b ELISA 配体结合方法学验证

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配体结合分析的某些进展

国际放射医学核医学杂志 1985年第2期09卷 102-106页

作者：任均田张弛林祥通一六九医院上海华山医院同位素室

配体结合分析是临床实验检查中最重要的发展之一,它已成为几乎各个医学领域实验室检查的一部分,本文简述最有临床意义的某些应用方面的进展。一、下丘脑-垂体-甲状腺轴***;测定血浆中游离与结合状态的T;间存在着动态平衡。T;与三种结合... 详细信息

配体结合分析是临床实验检查中最重要的发展之一,它已成为几乎各个医学领域实验室检查的一部分,本文简述最有临床意义的某些应用方面的进展。一、下丘脑-垂体-甲状腺轴***;测定血浆中游离与结合状态的T;间存在着动态平衡。T;与三种结合蛋白的结合常数为:TBG:2×10;/M;TBPA:2×10;/M;ALb:2×10;/M。正常者仅0.05%的T;呈游

关键词：受体免疫活性靶细胞巨球蛋白胰蛋白酶激素胃蛋白酶原酶蛋白配体结合下丘脑间脑

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配体结合分析的某些进展

国外医学.临床生物化学与检验学分册 1986年第4期 12-16页

作者：任均田李振甲解放军一六九医院解放军总医院

自60年代初Yalow和Berson首先用放射免疫分析法测定人血清胰岛素以来,配体结合分析技术(Ligand Binding Assay)有了惊人的发展。本文拟简述近年来其有关方法学的某些进展。标记类型在配体结合分析中,可作为标记物的有放射性同位素、噬... 详细信息

自60年代初Yalow和Berson首先用放射免疫分析法测定人血清胰岛素以来,配体结合分析技术(Ligand Binding Assay)有了惊人的发展。本文拟简述近年来其有关方法学的某些进展。标记类型在配体结合分析中,可作为标记物的有放射性同位素、噬菌体、化学发光前体物、酶、红细胞、荧光素、胶乳颗粒、微脂体、金属原子和稳定的游离原子团。配体结合

关键词：配体结合激素受体抗体结合剂自动化仪器温育

甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性部位巯基与配体结合的关系

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中国科学 1980年第12期 1209-1215页

作者：赵康源练永宁何燕生邹承鲁中国科学院生物物理研究所

本文用荧光滴定、透析平衡和分子筛柱层析等方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下简称为GAPDH)与配体的结合进行了研究. 荧光滴定的实验结果,GAPDH酶肮与εNAD~+结合为负协同性,如果酶的Cys-149巯基经碘代乙酸或四硫硫酸钠修饰后,则不仅酶与... 详细信息

本文用荧光滴定、透析平衡和分子筛柱层析等方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下简称为GAPDH)与配体的结合进行了研究. 荧光滴定的实验结果,GAPDH酶肮与εNAD~+结合为负协同性,如果酶的Cys-149巯基经碘代乙酸或四硫硫酸钠修饰后,则不仅酶与εNAD~+结合减弱,并且其结合的负协同性也明显减弱.与此相应,εNAD~+与酶蛋白结合后εA部分的荧光增强也不如未修饰酶那样明显.分子筛柱层析的结果指出,当酶的Cys-149巯基经化学修饰后,酶与ATP的结合能力也大大下降.这些结果都说明,酶活性部位Cys-149巯基不仅和酶与NAD~+的菸酰胺部分的结合有关,它的修饰还直接影响到酶的腺嘌呤结合部位,从而影响到酶与配体结合的协同性质.荧光滴定和透析平衡的结果还表明,温度升高酶与εNAD~+结合的负协同性增强,酶与ATP的结合则由非协同性变为负协同性.

关键词：协同性乙酸醋酸饱和脂肪酸荧光滴定 ATP 碘代 NAD 透析平衡荧光增强活性部位配体结合甘油醛多元醛磷酸磷化合物脱氢酶巯基

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CYP3A4的配体结合机制

国外医学（药学分册） 2007年第3期34卷 236-237页

作者：王琼郭金华

细胞色素P4503A4(CYP3A4)是药物研发过程中研究最多也最具挑战性的药物代谢酶。研究表明CYP3A4有一个活性极强的酶结合位点且具有多配体结合的可能性。[第一段]

关键词： CYP3A4 配体结合结合机制药物代谢酶药物研发细胞色素结合位点活性

采用放射性配体结合测定法检测幼儿组织谷氨酰胺转移酶自身抗体

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世界核心医学期刊文摘（儿科学分册） 2005年第3期1卷 9-10页

作者： Agardh D. Carlsson A. Lynch K. 李开 Department of Paediatrics Malmo University Hospital SE-205 02 Malmo Sweden

目的:前瞻性筛查腹腔疾病(CD)易感性幼儿,测定其体内抗组织谷氨酰胺转移酶(tTG)自身抗体水平。方法:共有652名幼儿被纳入试验,其平均年龄为2.9岁(2.5-4.2岁),采用放射性配体结合测定法,检测抗组织谷氨酰胺转移酶免疫球蛋白A(IgA-tTG)和G... 详细信息

目的:前瞻性筛查腹腔疾病(CD)易感性幼儿,测定其体内抗组织谷氨酰胺转移酶(tTG)自身抗体水平。方法:共有652名幼儿被纳入试验,其平均年龄为2.9岁(2.5-4.2岁),采用放射性配体结合测定法,检测抗组织谷氨酰胺转移酶免疫球蛋白A(IgA-tTG)和G (IgA-tTG);采用间接荧光免疫测定法,检测肌内膜抗体免疫球蛋白A(EMA)。对于自身抗体阳性儿童,平均1.2年(0.2-1.9年)后再次进行检测。对于自身抗体水平持续偏高的儿童,进行肠组织活检。结果:试验基准, 全部625名受试儿童中,3.2%(95%CI 1.9%-4.6%) 至少有1种自身抗体呈阳性:2.5%(95%CI 1.3%- 3.7%)出现IgA-tTG,1.7%(95%C1 0.7%-2.7%)

关键词：自身抗体谷氨酰胺转移酶配体结合肠组织活检荧光免疫测定法免疫球蛋白肌内膜 IgG 上皮内淋巴细胞

CR3的Ⅰ结构域的克隆和在CHO细胞中的表达及配体结合特性的研究

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徐州医学院学报 1998年第6期18卷 431-434页

作者：赵惠仁 LAW SKA CAI TQ WRIGHT S 英国牛津大学生物化学系ＭＲＣ免疫化学研究所美国洛克菲勒大学细胞生理和免疫学实验室生物化学与分子生物学研究中心

目的研究白细胞整合素ＣＲ３α亚基的Ⅰ结构域在配体结合中的作用。方法克隆ＣＤ１１ｂ的Ⅰ结构域，用重叠ＰＣＲ的方法将其与信号肽ＤＮＡ连接，克隆到表达载体ＰＥＥ６ＨＣＭＶ．ＧＳ，转化ＣＨＯ－Ｋ１细胞。表达的Ⅰ－结构域经ＳＰ... 详细信息

目的研究白细胞整合素ＣＲ３α亚基的Ⅰ结构域在配体结合中的作用。方法克隆ＣＤ１１ｂ的Ⅰ结构域，用重叠ＰＣＲ的方法将其与信号肽ＤＮＡ连接，克隆到表达载体ＰＥＥ６ＨＣＭＶ．ＧＳ，转化ＣＨＯ－Ｋ１细胞。表达的Ⅰ－结构域经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ｍｏｎｏ－Ｓ柱纯化后，与Ｃ３ｂｉ进行配体结合实验。结果用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得重组的Ⅰ结构域分子量为２９ｋＤ。重组的Ⅰ结构域可以与Ｃ３ｂｉ结合，Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析示结合常数为３００±１１３ｎｍｏｌ／Ｌ，这种结合可以被抗Ⅰ－结构域单克隆抗体ＬＰＭ１９Ｃ和ＥＤＴＡ抑制。结论Ⅰ结构域对于结合单体Ｃ３ｂｉ是必要的和充分的，结合需要二价阳离子。

关键词：整合素CR3 Ⅰ结构域 C3bi 配体结合 CHO细胞表达