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发展亲和质谱技术加速G蛋白偶联受体的配体筛选和药物发现

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自然杂志 2021年第1期43卷 32-38页

作者：张冰洁水雯箐上海科技大学iHuman研究所上海201210 上海科技大学生命科学与技术学院上海201210

基于靶蛋白配体亲合作用检测的亲和质谱技术与常规高通量筛选技术相辅相成,已发展成为药物先导化合物早期发现流程中的关键技术之一。G蛋白偶联受体(GPCR)家族由于其特殊的生化性质,对基于亲合作用的配体筛选和配体表征提出了巨大的技... 详细信息

基于靶蛋白配体亲合作用检测的亲和质谱技术与常规高通量筛选技术相辅相成,已发展成为药物先导化合物早期发现流程中的关键技术之一。G蛋白偶联受体(GPCR)家族由于其特殊的生化性质,对基于亲合作用的配体筛选和配体表征提出了巨大的技术挑战。文章主要介绍亲和质谱技术用于GPCR配体筛选的基本原理及其特点,并总结该技术用于大规模化合物库及天然草本粗提物筛选的前沿进展。

关键词：亲和质谱 G蛋白偶联受体配体筛选药物发现

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基于纳米金的吸附剂配体筛选方法研究

基于纳米金的吸附剂配体筛选方法研究

利用亲和质谱技术从中药材提取物中筛选马尔堡病毒核蛋白的小分子配体

2011年全国高分子学术论文报告会

作者：王蔚王珺魏芹芹张赛晖袁直功能高分子材料教育部重点实验室南开大学高分子化学研究所

＜正＞本文提出了一种基于纳米金溶胶光学特性的亲和吸附剂配体筛选方法。将吸附质修饰到纳米金溶胶上,将待选配体制备成线性聚合物,考察修饰吸附质的纳米金溶胶对含有不同配体的线性聚合物的响应状况,通过观察金溶胶的变色聚集情况判... 详细信息

＜正＞本文提出了一种基于纳米金溶胶光学特性的亲和吸附剂配体筛选方法。将吸附质修饰到纳米金溶胶上,将待选配体制备成线性聚合物,考察修饰吸附质的纳米金溶胶对含有不同配体的线性聚合物的响应状况,通过观察金溶胶的变色聚集情况判断配体对吸附

关键词：纳米金溶胶配体筛选吸附亲和性

来源： cnki会议评论

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南开大学学报（自然科学版） 2016年第5期49卷 1-7页

作者：付旭李利新汪志华王跃飞郭宇水雯箐天津科技大学生物工程学院天津300457 天津国际生物医药联合研究院高通量分子药物筛选中心天津300457 天津中医药大学中医药研究院天津300193 南开大学生命科学学院天津300071

马尔堡病毒的RNA基因组编码7种结构蛋白,其中核蛋白在基因组的复制和核衣壳形成中发挥重要作用,成为十分有吸引力的抗病毒药物潜在靶标.实验利用亲和质谱技术从甘草提取物中筛选马尔堡核蛋白的配体.首先从甘草粗提物中发现了可能与蛋白... 详细信息

马尔堡病毒的RNA基因组编码7种结构蛋白,其中核蛋白在基因组的复制和核衣壳形成中发挥重要作用,成为十分有吸引力的抗病毒药物潜在靶标.实验利用亲和质谱技术从甘草提取物中筛选马尔堡核蛋白的配体.首先从甘草粗提物中发现了可能与蛋白结合的配体甘草查尔酮A.在此基础上,对甘草中已知组分的单体混合物和甘草查尔酮A单体分别进行亲和质谱分析,验证了粗提物的质谱筛选结果.而后进一步利用SPR实验确认甘草查尔酮A单体对核蛋白靶标的结合作用,进而通过一系列生化实验发现该单体对马尔堡核蛋白热稳定性和构象均能产生功能性影响.实验发展的亲和质谱技术为从中草药提取物中直接筛选新型抗病毒药物分子提供了简便高效的新方法.

关键词：马尔堡核蛋白甘草粗提物亲和质谱配体筛选

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hPPARα配体的HPLC-UV法筛选平台的建立

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hPPARα配体的HPLC-UV法筛选平台的建立

作者：刘华重庆医科大学

学位级别：硕士

目的建立人过氧化物酶体增殖物活化受体alpha(human peroxisome prolifterator-activated receptors alpha,hPPARα)配体的HPLC-UV法筛选平台。方法含重组质粒的宿主菌(pMAL-p2X-hPPARs/TB1)经最佳优化条件诱导后,超声破碎取上清,产物用多糖亲和树脂进行纯化获MBP-hPPARsLBD,再用Xa因子酶切、多糖亲和树脂层析和DEAE-52阴离子交换层析纯化回收hPPARsLBD。采用HiTrap desalting (SephadexG-25,1.6×2.5cm)色谱柱,柱温8℃,以PBS为流动相,进样量为20μL,洗脱速度为1.0 mL/min。以检测苯扎贝特(Bez)进行方法学考察。然后取40μg hPPARαLBD或80μg MBP-hPPARαLBD,以Bez为阳性配体, AA为竞争性冷药,反应达平衡后取100μL进样,进行结合反应条件的优化。在优化的反应条件下,取不同浓度的Bez(阳性药)和罗格列酮(Ros)(阴性药)进行结合实验,计算特异性结合(SB)。根据实验结果确立HPLC-UV法筛选hPPARs配体的判断标准。最后以hPPARα的选择性激动剂非诺贝特(Fen)和Bez、hPPARγ的选择性激动剂Ros和吡格列酮(Pio)为待试药,检验所建立的HPLC-UV法hPPARs配体筛选平台的有效性。结果含重组质粒的宿主菌经最佳优化条件诱导,从1L培养物中可获得约20 mg MBP-hPPARsLBD。经纯化以及酶切回收,获得了电泳纯的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD,其产量分别为14 mg/L和5 mg/L。色谱图中PPARs的保留时间为1.6 min,而Bez的保留时间为6.3min。分离效果较好,柱效高,峰形对称。Bez在0.5-200μmol/L(3.6-1447 ng)范围内线性良好, LOD为0.2μmol/L,,日内、日间RSD均小于5%。MBP-hPPARαLBD和hPPARαLBD同Bez的结合按照最佳优化条件(25℃孵育40 min pH值分别以8.4和8.00,)反应,SB/TB值均超过了65%。根据分子排阻色谱分离(Molecular Exclusion Chromatography,MEC)理论,取不同浓度的Bez(阳性药)和Ros(阴性药)进行结合实验,确定SB同药物浓度存在量-效关系作为hPPARs配体的判断标准,建立了HPLC-UV法hPPARα配体筛选平台。经检验,该平台能从待试药中有效地筛查出hPPARα的阳性配体。获得Bez和Fen的KD值分别为0.91和2.41μmol/L。结论HPLC-UV法筛选hPPARα配体是一种简便、有效的受体配体筛选方法。

关键词： MBP hPPARα HPLC-UV 配体筛选

磁珠固定二氢叶酸还原酶指数富集筛选混合物中低丰度高亲和力配体

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磁珠固定二氢叶酸还原酶指数富集筛选混合物中低丰度高亲和力配体

作者：周伟重庆医科大学

学位级别：硕士

筛选混合物库发现药物先导化合物较传统逐一合成纯化合物库再筛选具有显著成本和效率优势,前期建立了指数富集筛选混合物库新技术,为明确其筛选混合物库中低丰度药用级亲和力配体的适用性,本文以磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Myc... 详细信息

筛选混合物库发现药物先导化合物较传统逐一合成纯化合物库再筛选具有显著成本和效率优势,前期建立了指数富集筛选混合物库新技术,为明确其筛选混合物库中低丰度药用级亲和力配体的适用性,本文以磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacterium tuberculosis DHFR,MtDHFR)为药靶,建立了指数富集筛选混合物中低丰度MtDHFR高亲和力配体体系,并初步应用于组合合成及天然产物混合物中预期配体的筛选。表达靶蛋白Mt DHFR并Ni-NTA磁珠固定化及表征;构建N端带6×His标签MtDHFR的表达质粒pET28a:dfrA,在*** BL21(DE3)中成功重组表达并进行酶学性质表征。利用6×His标签与Ni-NTA磁珠螯合固定6×His-MtDHFR,发现Ni-NTA磁珠对MtDHFR固定化容量为(93±12)mg/g磁珠(n=3),但固定酶活性保留不超过32%;进一步研究发现Ni显著抑制酶活性,且EDTA与Ni呈协同抑制效应,而Fe无显著干扰。通常Ni-NTA鳌合带6His标签酶复合物在pH 8.0及以上才能维持稳定;但6His-Mt DHFR在pH 8.0时保留的活性很低。因此,Ni-NTA磁珠鳌合固定方案不适于固定化MtDHFR用于磁分离筛选配体混合物库。羧基磁珠固定化MtDHFR及表征。晶体结构(PDB code:4KNE)显示,Mt DHFR氨基酸序列仅有1个赖氨酸(Lys-53)及N端伯氨基,都远离活性位点,因此,可通过此氨基与磁珠表面活化羧基生成酰胺固定化。羧基磁珠固定化MtDHFR的容量为(8.6±0.6)mg/g磁珠(n=3),相对于游离酶活性,固定酶保留活性(87±4)%(n=3);游离和固定化MtDHFR在反应缓冲液中0℃保存16 h活性都无显著改变,但在25℃保存16 h,游离酶活性下降近60%,羧基磁珠固定化MtDHFR活性下降仅约35%,可见固定酶储存稳定性比游离酶显著提高,且MtDHFR羧基磁珠固定前后对抑制剂甲氨蝶呤(MTX)的IC无显著性差异(P>0.05)。因此,此羧基磁珠固定化MtDHFR方案满足配体混合物库中高亲和力配体的选择性指数富集与筛选要求。基于固定化Mt DHFR为靶指数富集筛选配体混合物体系建立及初步应用。以典型抑制剂MTX为母体设计合成不同亲和力的系列衍生物。通过人工混合构成含MTX约1%的模拟混合物,外加参考配体,构成筛选前样品。以羧基磁珠固定MtDHFR为靶,通过降低靶蛋白用量至配体平均结合率低于10%,并使配体混合物发生竞争结合而选择性富集高亲和力配体,以前一轮提取所得配体混合物用于后一轮的筛选前样品,连续两轮迭代筛选,验证了含量为1%的高亲和力配体MTX的指数富集效应。进一步以MTX和芳酸混合物与胺及醇混合物组合合成成分复杂的含有痕量残留MTX的混合物,应用此系统经过两轮迭代筛选,实现了痕量残留MTX的指数富集。以中药材姜黄提取物,适当稀释后外加痕量候选配体MTX和参考配体组成天然产物模拟混合物筛选前样品,同样经两轮筛选可实现选择性富集天然产物混合物中的高亲和力痕量MTX。综上所述,通过重组表达Mt DHFR并优化磁珠固定化方案,在模拟混合物验证了预期高亲和力配体的指数富集效应,并成功应用于组合合成混合物及天然混合物中含量低于1%亲和力为纳摩尔级配体的选择性富集筛选。由此明确了磁分离迭代指数富集筛选混合物中痕量纳摩尔级亲和力药用配体的适用性,进一步优化将有望用于从现有抗结核活性中草药中发现高亲和力先导配体。

关键词：结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶磁珠固定化酶配体筛选指数富集

磁珠富集与液相色谱-质谱联用结合筛选枳壳中脂肪酶抑制剂

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高等学校化学学报 2012年第12期33卷 2692-2696页

作者：陈锥陶益王怡王毅浙江大学药物信息研究所杭州310058 天津中医药大学中医药研究院天津300193

提出了一种磁珠收集与液相色谱-质谱联用(LC-MS)结合用于快速筛选中药提取物中的脂肪酶抑制剂的方法.通过制备键合脂肪酶的磁珠,将其与枳壳总黄酮孵育后,筛选出枳壳中脂肪酶的配体.通过LC-MS分析发现,4个化合物均是潜在的脂肪酶抑制剂,... 详细信息

提出了一种磁珠收集与液相色谱-质谱联用(LC-MS)结合用于快速筛选中药提取物中的脂肪酶抑制剂的方法.通过制备键合脂肪酶的磁珠,将其与枳壳总黄酮孵育后,筛选出枳壳中脂肪酶的配体.通过LC-MS分析发现,4个化合物均是潜在的脂肪酶抑制剂,鉴定其分别为柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和枸橘苷.对4个化合物进行了体外脂肪酶抑制活性验证.研究结果表明,新橙皮苷、橙皮苷和枸橘苷具有显著的脂肪酶抑制活性,IC50分别为48.04,52.45和46.18μg/mL,其中枸橘苷具有脂肪酶抑制活性为首次报道.结果表明,磁珠富集与LC-MS集成技术能够用于快速发现中药活性成分.

关键词：脂肪酶磁珠富集枳壳配体筛选

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左氧氟沙星多组分晶体的制备与性能研究

化学工业与工程 2024年第6期41卷 136-148页

作者：陈武顾振东郑智勇梁小小刘诗苑江燕斌广东肇庆星湖生物科技股份有限公司华南理工大学化学与化工学院

以左氧氟沙星为模型药物，采用偏最小二乘回归模型预测了可能与左氧氟沙星形成多组分晶体的配体，以指导左氧氟沙星多组分晶体样品的制备，并探究了样品的稳定性和体外抗菌活性。结果表明，所选17种配体中，7种配体成功与左氧氟沙星形... 详细信息

以左氧氟沙星为模型药物，采用偏最小二乘回归模型预测了可能与左氧氟沙星形成多组分晶体的配体，以指导左氧氟沙星多组分晶体样品的制备，并探究了样品的稳定性和体外抗菌活性。结果表明，所选17种配体中，7种配体成功与左氧氟沙星形成多组分晶体，其中5种配体被预测模型命中。各预测模型中，汉森溶解度参数/COSMO-RS双参数预测模型的准确率最高，对实验体系的总体准确率和阳性准确率分别为82.4%和83.3%。其中5种多组分晶体样品的稳定性与稳定性良好的原料药相当，且所制备的7种多组分晶体样品的抗菌活性均明显提高，预期在实现与原料药同等抗菌活性的前提下，可有效降低给药剂量，减少不良反应。

关键词：左氧氟沙星多组分晶体配体筛选制备性能

氟喹诺酮类药物多组分晶体配体高效预测、晶体制备及性能研究

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氟喹诺酮类药物多组分晶体配体高效预测、晶体制备及性能研究

作者：郑智勇华南理工大学

学位级别：硕士

多组分晶体是改善药物理化性质的有效途径,然而筛选与活性药物成分形成多组分晶体的配体仍是一大挑战。多组分晶体配体可通过基于理论的参数化方法筛选,其中多参数预测方法能有效弥补单一参数方法的不足,提高配体筛选的效率。氟喹诺酮... 详细信息

多组分晶体是改善药物理化性质的有效途径,然而筛选与活性药物成分形成多组分晶体的配体仍是一大挑战。多组分晶体配体可通过基于理论的参数化方法筛选,其中多参数预测方法能有效弥补单一参数方法的不足,提高配体筛选的效率。氟喹诺酮类药物是一人工合成的抗菌药物,部分药物存在水溶性差、稳定性差、生物利用度低等问题。本文提出了一种基于偏最小二乘回归分析的配体预测筛选策略,以氟喹诺酮类药物中的环丙沙星和左氧氟沙星为模型药物,预测可能与环丙沙星和左氧氟沙星形成多组分晶体的配体,并制备其多组分晶体、测试其性能。本文主要工作如下:(1)通过文献溯源获取了101个阳性样本和阴性样本作为训练集,结合汉森溶解度参数、分子表面静电势、真实溶剂导体样筛选模型(COSMO-RS)等参数化方法,建立了7个基于偏最小二乘回归分析的配体筛选模型。(2)采用建立的预测模型筛选可能与环丙沙星形成多组分晶体的配体,通过实验成功制备了7种环丙沙星多组分晶体。各预测模型中,汉森溶解度参数和COSMO-RS双参数模型具有最高准确性,其对于环丙沙星测试集的总体准确率和阳性准确率分别为85%和75%。对环丙沙星多组分晶体样品进行了结构表征、溶出速率测试和稳定性测试,结果表明,制备的多组分晶体样品的水溶性有所改善,呈现两种不同的溶出行为,并显著提高了环丙沙星的稳定性。(3)采用建立的预测模型筛选可能与左氧氟沙星形成多组分晶体的配体,通过实验成功制备了7种左氧氟沙星多组分晶体。各预测模型中,汉森溶解度参数和COSMO-RS双参数模型具有最高准确性,其对于左氧氟沙星测试集的总体准确率和阳性准确率分别为82.4%和83.3%。对左氧氟沙星多组分晶体样品进行了结构表征、稳定性测试和体外抗菌性能测试,结果表明,制备的多组分晶体样品具有良好的稳定性,并显著提高了左氧氟沙星的抗菌活性。本文为多组分晶体的预测和筛选提供了一种简单有效的策略,研究结果对开发氟喹诺酮类药物多组分晶体具有一定参考意义。

关键词：偏最小二乘分析多组分晶体配体筛选环丙沙星左氧氟沙星

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美国白蛾气味受体基因鉴定及功能初步研究

美国白蛾气味受体基因鉴定及功能初步研究

作者：周海凤东北师范大学

学位级别：硕士

美国白蛾（Hyphantria cunea）是一种世界性的检疫害虫,因其具有食性广、食量大、繁殖力惊人及适应性强等生物学特性,一旦入侵,极易爆发成灾。当前,美国白蛾已成为我国重要的外来入侵种之一,危害甚广,应及时进行防控。通过调控昆虫行为... 详细信息

美国白蛾（Hyphantria cunea）是一种世界性的检疫害虫,因其具有食性广、食量大、繁殖力惊人及适应性强等生物学特性,一旦入侵,极易爆发成灾。当前,美国白蛾已成为我国重要的外来入侵种之一,危害甚广,应及时进行防控。通过调控昆虫行为进行害虫绿色防控是近年来的热点之一。昆虫灵敏的嗅觉系统在昆虫的多种行为中发挥着至关重要的作用,在该系统中多种嗅觉相关蛋白参与完成昆虫的嗅觉识别过程,其中,气味受体（odorant receptor,OR）起着核心作用。由此,OR的功能研究成为昆虫嗅觉发生机制研究的核心元素,并为害虫的绿色防控提供策略。本研究基于基因组及转录组数据库对美国白蛾的OR基因进行鉴定,分析其同源性及组织表达特性,并探讨美国白蛾OR的功能特征,基于以上,探究美国白蛾对筛选到的一种主要气味配体（D-樟脑）的触角电生理及行为反应,主要研究结果如下:1.通过对美国白蛾基因组及转录组数据库的注释信息进行筛选及生信分析,鉴定得到65个美国白蛾候选OR基因。2.利用鳞翅目8种昆虫的485个OR构建了OR的系统发育树,预测出美国白蛾的ORco及3个候选PR,发现多数的OR存在较大的功能分化,少数OR的功能高度保守。3.基于FPKM值分析Hcun OR基因在美国白蛾成虫不同组织的表达特性,显示除9个Hcun OR外,其余的Hcun OR基因在昆虫的主要嗅觉器官触角中高表达。4.克隆得到Hcun ORco及9个Hcun OR基因,进行异源表达,基于双电极电压钳探讨8个Hcun OR的功能特征,显示Hcun OR10对3种芳香族化合物有反应,对苯甲醛反应最大;Hcun OR14对7种气味有反应,对苯乙醛反应最大;Hcun OR15对2种芳香族化合物有反应,对丁香酚反应最大;Hcun OR28未筛选到相应的气味配体;Hcun OR42对橙花叔醇有反应;Hcun OR46对11种气味有反应,对D-樟脑反应最大;Hcun OR47对20种气味有反应,这些气味多为脂肪族醇类和醛类化合物,对1-壬醛反应最大;Hcun OR50对6种不饱和短碳链化合物有反应,对橙花叔醇反应最大。5.利用EAG和Y型管测定美国白蛾对D-樟脑的触角电生理及行为反应,表明0.1μg/μL和1μg/μL的D-樟脑不引起美国白蛾雌、雄成虫显著的触角电生理反应,对美国白蛾行为选择无显著作用,而10μg/μL及100μg/μL的D-樟脑则引起美国白蛾雌、雄成虫显著的触角电位反应,对美国白蛾具有明显的趋避作用,且触角电生理反应及趋避效果随D-樟脑浓度升高而增强。综上,本研究鉴定了美国白蛾OR基因并分析了其同源性及组织表达特性,首次解析了美国白蛾7个OR的识别配体,且发现一定浓度的D-樟脑对美国白蛾有显著趋避作用,为阐明美国白蛾的特异性化学感受机理奠定了重要的基础,同时对未来绿色防控美国白蛾具有实践指导意义。

关键词：美国白蛾植物挥发物气味受体配体筛选 D-樟脑