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宁夏陕西野生苦味枸杞调查及其化学成分分析

植物遗传资源学报 2022年第5期23卷 1400-1413页

作者：袁海静袁汉民彭健印敏陈雨赵兴增刘兰英何进尚董立国张维军王相云王毅刘杨宁夏农林科学院国家枸杞工程技术中心银川750002 宁夏农林科学院银川750002 江苏省中国科学院植物研究所/江苏省植物资源研究与利用重点实验室南京210014 宁夏农林科学院农作物研究所银川750002 宁夏农林科学院荒漠化治理研究所银川750002 宁夏中宁县消化专科医院中宁755100 陕西省岐山县党校岐山722400

为了探索宁夏及陕西省野生枸杞种质资源的系统发育、遗传进化、成熟鲜果苦味、甜味演变规律,以及野生苦味枸杞苦味物质,系统调查、SLAF测序技术、超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱联用仪、紫外线波长鉴定法等方法被应用于本项... 详细信息

为了探索宁夏及陕西省野生枸杞种质资源的系统发育、遗传进化、成熟鲜果苦味、甜味演变规律,以及野生苦味枸杞苦味物质,系统调查、SLAF测序技术、超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱联用仪、紫外线波长鉴定法等方法被应用于本项研究。结果发现,从陕西省岐山县、扶风县到宁夏南部山区、引黄灌区、贺兰山东麓,野生枸杞成熟鲜果出现了由全苦、半苦、甜后苦(或甜后麻苦)、甜、甜后稍苦、全苦的大致变化趋势。聚类分析结果表明,宁夏及陕西40份野生枸杞资源可以划分为5大类,类群Ⅰ、类群Ⅱ、类群Ⅲ、类群Ⅳ均为野生苦味枸杞在分子水平的不同类型,类群Ⅴ为众多的从苦味到甜味的过渡类型野生种质,显示出了野生苦味枸杞的遗传多样性;栽培甜枸杞宁杞7号、宁夏海原县野生苦枸杞、宁夏西吉县野生苦枸杞、陕西省岐山县野生苦枸杞4种枸杞成熟鲜果样品在液质总离子流图的30~50min区域中,宁杞7号缺少3种野生苦味枸杞共同具有的波谱区段,经化学成分解析,其主要为甾体生物碱类,即澳洲茄碱和5,6-二氢澳洲茄碱。据此,野生苦味枸杞的苦味成分可能与甾体生物碱类成分如澳洲茄碱、5,6-二氢澳洲茄碱密切相关。本研究结果为深入研究、利用野生苦味枸杞种质资源,培育医药专用枸杞品种提供了理论基础。

关键词：野生苦味枸杞化学成分 UPLC-Q/TOF-MS 遗传进化树澳洲茄碱

河南地区猫细小病毒RC-2021株的分离鉴定及其灭活后免疫效果研究

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中国动物传染病学报 2023年

作者：徐彦召宋会帅申月华钟秋月董亚楠张伟涛胡建和王青河南科技学院动物科技学院开封正大农牧发展有限公司

为探究河南地区猫细小病毒(Feline panleukopenia virus， FPV)的流行情况并对其流行毒株的遗传变异和演化规律进行分析，并评估其灭活疫苗的免疫效果，本研究对采集的23 份疑似由FPV引起的猫白细胞减少症的临床样品进行了PCR鉴定，并对... 详细信息

为探究河南地区猫细小病毒(Feline panleukopenia virus， FPV)的流行情况并对其流行毒株的遗传变异和演化规律进行分析，并评估其灭活疫苗的免疫效果，本研究对采集的23 份疑似由FPV引起的猫白细胞减少症的临床样品进行了PCR鉴定，并对其VP2基因进行同源性和遗传进化分析，同时获得对应样品的全基因序列。将鉴定为阳性的对应样品无菌接种于猫肾细胞(Crandell Reese Feline Kidney， CRFK)细胞并盲传3代进行病毒的分离和鉴定。利用分离到的病毒进行动物回归试验并制备灭活疫苗免疫试验猫进行安全性和免疫原性评价。结果表明，从23 份病料中检测到3 份FPV阳性样品，接种了阳性样品的CRFK细胞出现明显的细胞病变，TCID50值为10-6.26/0.1 mL，透射电镜下观察到大小约20 nm的病毒粒子。分离株基因全长4 442 bp，与下载的其他株病毒基因序列同源性在98.3%-99.8%之间，氨基酸序列比较保守，分离株病毒与中国哈尔滨分离的毒株FPV-XJ1亲缘关系比较接近。该毒株为强毒株，试验猫出现明显的临床症状，病理剖检病变明显，将病毒灭活制备疫苗后免疫猫未导致其出现不良反应，免疫血清经1∶200稀释后能够中和分离株病毒对CRFK细胞的感染，细胞形态完整。本研究成功分离了一株强毒猫细小病毒株并制备了相应的灭活疫苗，丰富了国内FPV的流行病学资料和流行毒株信息，可用于评价疫苗的免疫效果，所制备的病毒灭活制品可有效预防猫泛白细胞减少症。

关键词：猫细小病毒 IFA 分离鉴定遗传进化树动物回归试验灭活疫苗

猪流行性腹泻病毒变异株分离鉴定及攻毒模型建立

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生物学杂志 2023年第3期40卷 69-73页

作者：焦安琪郭效珍陈智于江于克戬逯晓寒辛忠昊韩先杰吴家强青岛农业大学动物医学院青岛266109 山东省农业科学院畜牧兽医研究所山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室济南250000 山东省农业科学院家禽研究所山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室济南250000

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病。研究成功分离到一株PEDV,命名为PEDV-20200946。对该毒株的S基因进行测序分析,遗传进化树结果显示,该分离毒株属于G2亚群。通过Reed-Muench法测定该... 详细信息

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病。研究成功分离到一株PEDV,命名为PEDV-20200946。对该毒株的S基因进行测序分析,遗传进化树结果显示,该分离毒株属于G2亚群。通过Reed-Muench法测定该毒株毒价为106.1 TCID 50/mL。通过动物回归试验进一步探究该分离毒株对仔猪的致病情况,将12头20日龄仔猪平均分为3组,分别为口服攻毒组、口服+肌注攻毒组和对照组。攻毒后观察临床症状,72 h后采集各组的粪便及发病猪的肠道进行RT-PCR检测和免疫组化分析。结果显示,口服+肌注组仔猪发病最快,口服攻毒组次之,对照未发病。剖检攻毒组仔猪可见其肠壁变薄、肠道膨胀,内含大量黄色液体。免疫组化试验显示,攻毒组猪小肠内可检测到大量PEDV阳性信号,而对照组未检测到。研究建立了PEDV-20200946毒株仔猪攻毒模型,为深入研究PEDV流行毒株的分子特性以及弱毒疫苗的开发奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒流行毒株分离鉴定攻毒模型遗传进化树

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牦牛源产气荚膜梭菌青海分离株的生物学特性

中国兽医杂志 2022年第12期58卷 12-16页

作者：李宇鹏吴丹罗润波宋仁德格桑卓玛白吉索朗斯珠西藏农牧学院动物科学学院西藏林芝860000 青海玉树藏族自治州畜牧兽医工作站青海玉树815099 西藏自治区动物疫病预防控制中心西藏拉萨850014

为了解本实验室分离保存的1株牦牛源产气荚膜梭菌qinghai-12分离株的生物学特性,本试验通过多种生物学方法对该菌株的生物学特性进行分析。结果显示:该菌株在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、卵磷脂酶、乳糖、酪蛋白生化鉴定管中呈阳性反应,石蕊... 详细信息

为了解本实验室分离保存的1株牦牛源产气荚膜梭菌qinghai-12分离株的生物学特性,本试验通过多种生物学方法对该菌株的生物学特性进行分析。结果显示:该菌株在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、卵磷脂酶、乳糖、酪蛋白生化鉴定管中呈阳性反应,石蕊牛乳试管中呈现“汹涌发酵”现象;16S rRNA和多重PCR鉴定该菌株为牦牛源C型产气荚膜梭菌;该菌株按1%接种至梭菌增菌培养基,在4~8 h处于对数生长期;10 h为该菌株的最佳产毒时间,含量达4.173 mg/mL;依据16S rRNA遗传进化树分析,该菌株与北京人源(GenBank登录号:KP944154.1)、安多牦牛源(GenBank登录号:MN960262.1)、美国猪源(GenBank登录号:JQ607422.1)、华东兔源(GenBank登录号:KX986316.1)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性;最低抑菌浓度(MIC)测定结果显示,该菌株对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素表现为敏感。本试验通过对牦牛源C型产气荚膜梭菌生物特性的分析,为牦牛源产气荚膜梭菌后续研究及防治等方面提供一定的技术支持。

关键词：牦牛产气荚膜梭菌生长曲线遗传进化树最低抑菌浓度

新型鹅细小病毒的分离、遗传进化及Rep1蛋白的表达研究

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新型鹅细小病毒的分离、遗传进化及Rep1蛋白的表达研究

作者：王昱扬州大学

学位级别：硕士

短喙与矮小综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)自2015年爆发以来,对我国樱桃谷鸭养殖业造成了很大损失,感染鸭以体型矮小、喙短、站立行走困难为特征。新型鹅细小病毒(Novelgooseparvovirus,NGPV)为SBDS的病原。先前研究显... 详细信息

短喙与矮小综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)自2015年爆发以来,对我国樱桃谷鸭养殖业造成了很大损失,感染鸭以体型矮小、喙短、站立行走困难为特征。新型鹅细小病毒(Novelgooseparvovirus,NGPV)为SBDS的病原。先前研究显示,早期的NGPV分离株与2019年后的分离株在樱桃谷鸭胚适应性上存在明显差异。NGPV在田间流行已有七年,近年来的流行株是否产生新的变异尚不清楚。非结构蛋白Rep1在NGPV致病性和SBDS特征性临床症状的呈现上发挥决定性作用,对Rep蛋白开展深入研究对揭示NGPV致病机制十分关键。本论文研究中,对2021-2022年的NGPV分离株进行了基因组测序和遗传进化分析,对Rep1蛋白全长及其亚片段开展了基于原核系统的表达并研制了针对表达产物的多克隆抗体,研究结果为进一步探究NGPV致病性和致病机理奠定了基础,具体内容如下:一、三株NGPV的分离、定序及遗传进化分析从2021-2022年间收集的三份疑似SBDS阳性的组织样品,通过接种樱桃谷鸭胚,分离到三株NGPV,分别命名为SDDY21、SDJN21和SDWF22株。三株病毒传代后稳定在69-142 h内致死鸭胚。SDWF22株第三代鸭胚传代毒的ELD50为5×105 26/mL,非常接近于2019年分离株SDJN19(5×105.5/mL),而明显高于2016年分离株SDHT16(5×102.5/mL)。三个分离株的基因组均由5 054个核苷酸组成,这三个分离株与2019年NGPV分离株SDLC19和SDJN19的同源性为99.5%-99.8%,而与2016年分离株SDHT16的同源性略低,为98.7%-98.8%。三个分离株的末端倒置重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)均由418个核苷酸组成,与SDJN19株ITR的同源性均为100%,而这四个毒株的ITR与2016年分离株SDHT16和AH1605的同源性略低,分别为98.1%和98.6%,后者的ITR由416个核苷酸组成。三个分离株的Rep1编码框均由1 884 nt组成,彼此同源性高达99.9%-100%。三个毒株Rep1蛋白与2015-2016年NGPV分离株的核苷酸同源性略低,为98.9%-99.1%,与2019年分离株SDJN19和SDLC19的同源性为99.5%-99.8%;相比之下,三个毒株与经典型GPV的Rep1蛋白核苷酸同源性仅为96.0%-96.8%,其中同源性最高的为来自匈牙利的GPV B株,同源性为96.8%。Rep1蛋白氨基酸序列比对显示,与经典型GPV毒株相比,包括三个新分离株在内的共15个NGPV毒株呈现出11个特征性的氨基酸点突变。三个新分离株,除了与其它NGPV毒株具有一致的特征性氨基酸位点外,还在7个位点上形成了自身的特征性氨基酸,而2019年分离株在这些位点上的氨基酸则呈现出过渡特征。SDDY21、SDJN21、SDWF22三个毒株的VP1 蛋白均由2 199个核苷酸组成,彼此间核苷酸同源性为99.7%-99.8%,与SDJN19和SDLC19的同源性为99.5%-99.8%,与 2015-2016 年间的 6 个分离株(JS1、SDLC01、AH1605、AH0606、QH15 和 ADHT16)的同源性为98.6%-98.9%。相比之下,这三个新NGPV分离株与大陆和台湾地区经典GPV毒株的VP1核苷酸同源性仅有94.4%-94.8%,而与欧洲的GPVB株的同源性则略高,为96.0%-96.1%。进一步的氨基酸序列比对显示,包括三个新分离株在内的共15个NGPV毒株与经典型GPV毒株之间具有14个特征性氨基酸差异,在这些差异氨基酸位点中,有9个位点(28、35、41、207、210、524、537、575和703位)与欧洲的B株相一致。结果提示,流行于我国樱桃谷鸭中的NGPV更有可能在欧洲的B株基础上演变而来。以Rep1和VP1构建的遗传发生树均显示所有NGPV毒株形成了不同于经典型GPV的独立分支,但同时也显示,三个新分离株与2019年的分离株处于一个亚分支,而SBDS爆发早期的分离株则处于另一个更为紧密的亚分支。二、NGPV Rep1蛋白及其亚片段的原核表达和多抗制备NGPV与经典型GPV的Rep 1蛋白之间存有特征性氨基酸差异,Rep 1蛋白在NGPV致病性上发挥关键作用。Rep1蛋白的N端和C端分布有不同的功能结构域。原核系统表达Rep1蛋白的研究已多有报道,但大多以包涵体状态存在。本研究中,通过对表达载体、诱导温度、IPTG浓度进行试验比较,最终选择以pET-28a载体表达Rep1的N端200个氨基酸片段(后文简称为Rep1N),以pGEX-6p-1为载体表达Rep1蛋白及Rep1蛋白的C端200个氨基酸(后文简称为Rep1C)。三个蛋白均在大肠杆

关键词：新型鹅细小病毒病毒分离遗传进化树原核表达 Rep1蛋白多克隆抗体

一株塞内卡病毒A全基因组序列测定与致病性分析

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畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 820-826页

作者：赖隆永刘小龙谭礼宁叶盛聪邱灵姗陈盛勇刘楚楚徐磊派生特(福州)生物科技有限公司福州350500 福建农业职业技术学院福州350303

本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因... 详细信息

本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR扩增、测序、拼接,获得SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析;并通过滴鼻攻毒3~4周龄仔猪。结果表明,SVA-FJLY株基因组全长7275 bp(不包括PolyA),SVA-FJLY株基因组存在一个多聚蛋白、VP1蛋白和VP2蛋白。SVA-FJLY株与参考毒株之间的基因组一级结构有较高的相似性,与HeB01-2017株(MF967574.1)相似性最高,达98.5%;而与SVA原型毒株SVV-001株(DQ641257.1)的相似性较低,为93.9%。SVA-FJLY株与国内几个毒株属于同一个分支,与国内的HeB01-2017株亲缘关系最近,同时与国外Colombia-2016株(KX857728.1)的亲缘关系最近。通过动物试验发现试验组猪攻毒10 d后,试验组2/3发病,对照组3/3正常,未出现仔猪死亡。通过全基因组序列测定获得了SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析,明确SVA-FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的相似性关系,了解了SVA-FJLY株的致病性,为SVA的反向遗传学和疫苗的研制提供参考依据,同时也丰富了SVA的基因组信息数据库。

关键词：塞内卡病毒A RT-PCR扩增序列分析遗传进化树同源性 SVA-FJLY株致病性

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1株重组型番鸭细小病毒的分子特征解析

中国兽医学报 2021年第1期41卷 33-37页

作者：鲍芳秘清灵徐静雯王昱吴剑梅王志仙王建业朱国强扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了对1株番鸭细小病毒(MDPV)分离株NY18株的分子特征予以准确揭示,通过设计重叠PCR引物,扩增NY18株的完整基因组并进行了测序。结果显示,NY18株基因组由5071个碱基组成,5′和3′端末端倒置重复序列(inverted terminal repeats,ITR)均由... 详细信息

为了对1株番鸭细小病毒(MDPV)分离株NY18株的分子特征予以准确揭示,通过设计重叠PCR引物,扩增NY18株的完整基因组并进行了测序。结果显示,NY18株基因组由5071个碱基组成,5′和3′端末端倒置重复序列(inverted terminal repeats,ITR)均由424个碱基组成,其外侧385个碱基形成回文发夹结构。Simplot 3.5.1和RDP4软件分析表明,NY18株经历了2次重组事件,第1次重组产生在VP3基因的1.1 kb区域,第2次重组事件产生在P9启动子至Rep基因上游约100 bp区域内。2次重组均以经典型MDPV YY株作为主要亲本,而经典型鹅细小病毒(GPV)强毒株DY16和鹅胚化的弱毒疫苗株SYG61v作为次要亲本参与了重组。NY18株的ITR与经典型MDPV FM和YY株的同源性为97.9%和99.1%,而与GPV强毒株YZ99-6的同源性仅有86.0%,表明NY18株ITR仍来自于经典型MDPV。以VP1基因1.1 kb重组区片段构建遗传进化树,NY18株与经典型GPV处于同一分支,而以非重组区的Rep1基因1774 bp和VP1基因氨基端694 bp、羧基端405 bp片段分别构建遗传进化树,NY18株则与经典型MDPV处于同一分支。结果表明,NY18株既不同于经典型MDPV也不同于GPV,其本质是1株重组型的MDPV。

关键词：重组型番鸭细小病毒鹅细小病毒末端倒置重复分子特征遗传进化树

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一株牛源黄腐短杆菌的分离鉴定

福建农林大学学报（自然科学版） 2021年第1期50卷 103-107页

作者：刘嘎蒙小刚史量全东彦新潮洛蒙刘锴徐静内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古自治区肉牛疾病防控工程技术研究中心内蒙古通辽028000

从犊牛腐烂的牛蹄上分离病原菌,通过菌株培养、BD phoenix^(TM) 100生化鉴定、致病性试验、遗传进化树分析等方法,对该菌进行鉴定.结果表明,所分离菌株16S rRNA基因序列与GenBank已经上传的黄腐短杆菌同源性达99%,并最终确定该病原菌为... 详细信息

从犊牛腐烂的牛蹄上分离病原菌,通过菌株培养、BD phoenix^(TM) 100生化鉴定、致病性试验、遗传进化树分析等方法,对该菌进行鉴定.结果表明,所分离菌株16S rRNA基因序列与GenBank已经上传的黄腐短杆菌同源性达99%,并最终确定该病原菌为黄腐短杆菌(Brevibacterium luteolum),编号为LG-01.药敏试验结果显示,该病原菌对对氟苯尼考、庆大霉素、氧氟沙星等9种抗生素敏感,对卡那霉素、丁胺卡那、红霉素产生了耐药性.

关键词：牛黄腐短杆菌鉴定 PCR 遗传进化树药物敏感性

K亚群禽白血病病毒分离株基因测序与鉴定分析

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黑龙江畜牧兽医 2021年第23期 88-93,155页

作者：沈晓鹏曹斌王传峰陈则东马跃朱建平王成丽叶建强俞燕李拓凡张俊江苏农牧科技职业学院江苏泰州225300 扬州大学兽医学院江苏扬州225009

为了对从江苏省某种鸡场保种的崇仁麻鸡血浆中分离的禽白血病病毒(ALV)进行序列测定和亚群鉴定,试验采用ELISA法检测血浆样品p27抗原,并用从阳性血浆中分离的病毒接种DF1细胞进行免疫荧光检测,提取前病毒DNA,用ALV亚群鉴定引物进行PCR鉴... 详细信息

为了对从江苏省某种鸡场保种的崇仁麻鸡血浆中分离的禽白血病病毒(ALV)进行序列测定和亚群鉴定,试验采用ELISA法检测血浆样品p27抗原,并用从阳性血浆中分离的病毒接种DF1细胞进行免疫荧光检测,提取前病毒DNA,用ALV亚群鉴定引物进行PCR鉴定,前病毒DNA分3段扩增并测序,对测序结果进行拼接,用MEGA 7.0软件以NJ法对分离株病毒gp85基因编码的氨基酸序列和参考株进行遗传进化分析,采用DNAStar 7.0软件以Clustal W法对参考株与分离株病毒的gp37基因进行比对分析。结果表明:有1份样品的p27抗原ELISA反应呈阳性,免疫荧光检测也呈阳性,将该分离株命名为JS20CR13。K亚群引物PCR检测出大小为560 bp的目的片段。前病毒全基因组总长7 481 bp,其中env基因大小为1 617 bp(gp85基因1 008 bp,编码336个氨基酸;gp37基因大小为609 bp,编码203个氨基酸)。与各参考株对比,分离株JS20CR13的gp85基因序列与K亚群参考株同源性为94.0%~99.0%,明显高于其他亚群;gp85基因编码氨基酸序列与已经鉴定为ALV-K的参考株病毒位于同一个进化分支,而与其他亚群的遗传进化距离较远。分离株JS20CR13的gp37基因序列与ALV-K参考株JS14CZ01同源性最高,达99.0%。说明分离株JS20CR13与已经鉴定为ALV-K的参考株病毒位于同一个进化分支,分离株为K亚群ALV。

关键词： K亚群禽白血病病毒崇仁麻鸡遗传进化树 gp85基因 gp37基因