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刚地弓形虫RH株速殖子在HeLa细胞系体外培养的实验观察

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第6期26卷 452-456页

作者：吴亮陈盛霞李琳婕车飞虎邓红艳姜旭淦江苏大学基础医学与医学技术学院镇江212013

目的建立稳定高效的刚地弓形虫RH株速殖子(以下简称弓形虫速殖子)体外培养模型。方法①将HeLa细胞(1×104个)接种置于细胞培养皿内底部的盖玻片,12h后将纯化的弓形虫速殖子接种于细胞培养皿(1×104个/皿),继续培养0.5～96h,观察弓形虫... 详细信息

目的建立稳定高效的刚地弓形虫RH株速殖子(以下简称弓形虫速殖子)体外培养模型。方法①将HeLa细胞(1×104个)接种置于细胞培养皿内底部的盖玻片,12h后将纯化的弓形虫速殖子接种于细胞培养皿(1×104个/皿),继续培养0.5～96h,观察弓形虫速殖子在HeLa细胞内增殖情况;②将纯化的弓形虫速殖子接种于HeLa细胞后分为2组,一组于37℃分别培养24～120h后,移入25℃培养120h;另组于37℃培养48h后,移入25℃分别培养72～168h,观察不同温度和时间对弓形虫速殖子产率和活虫率的影响;③当培养的HeLa细胞80%发生细胞融合时更换速殖子培养液,同上法12h后接种纯化的弓形虫速殖子进行培养,当80%HeLa细胞被感染增殖的弓形虫速殖子涨破时,收集、计数弓形虫速殖子,并用其感染(3×106个/瓶)新的HeLa细胞,观察其连续传代情况;④每隔5代取弓形虫速殖子,腹腔接种昆明小鼠(3×106个/只),观察小鼠存活时间、评价该体外培养条件对弓形虫速殖子毒力的影响。结果接种弓形虫速殖子96h后HeLa细胞均被感染及涨破,培养弓形虫速殖子30代(3～4d为1代)增殖稳定,每代获得弓形虫速殖子1×107～5×107个,增殖5～20倍。各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为5.80～6.40d,毒力未见减弱(P>0.05)。HeLa细胞接种弓形虫速殖子,于37℃培养72h后,移至25℃培养120h,其产率高达40倍以上,活虫率为90%以上,仅残留极少量Hela细胞。结论刚地弓形虫RH株速殖子可在HeLa细胞中增殖并长期稳定传代。

关键词：刚地弓形虫速殖子 HeLa细胞体外培养

人包皮成纤维细胞和人子宫颈癌细胞体外培养弓形虫速殖子

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第3期27卷 229-231页

作者：吴亮章秋霞李婷婷陈盛霞曹建平江苏大学基础医学与医学技术学院.镇江212013 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所.卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

目的比较弓形虫RH株速殖子在人包皮成纤维细胞(humanforeskinfibroblast,HFF)和人子宫颈癌(HeLa)细胞的感染和细胞内增殖情况。方法分别于含一盖玻片的细胞培养皿(35mm)内培养HFF细胞和HeLa细胞。待形成单细胞层后各加入经3μm滤膜纯化... 详细信息

目的比较弓形虫RH株速殖子在人包皮成纤维细胞(humanforeskinfibroblast,HFF)和人子宫颈癌(HeLa)细胞的感染和细胞内增殖情况。方法分别于含一盖玻片的细胞培养皿(35mm)内培养HFF细胞和HeLa细胞。待形成单细胞层后各加入经3μm滤膜纯化的弓形虫RH株速殖子共培养,分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72和96h取出盖玻片,经吉氏染色镜下观察速殖子在两种细胞内的增殖情况。结果与HFF细胞共培养4h后,速殖子即可侵入HFF细胞,1个细胞内可见数十个速殖子;24h可见明显的假包囊,72h细胞被胀破。而与HeLa细胞共培养8h后速殖子才侵入细胞,每个细胞内可见3～5个速殖子,48h形成假包囊,96h大部分细胞被胀破。结论弓形虫RH株速殖子可在HFF细胞和HeLa细胞内增殖,在HFF细胞内的增殖速度快于HeLa细胞。

关键词：刚地弓形虫速殖子体外培养 HFF细胞 HeLa细胞

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金丝桃素体外抗刚地弓形虫速殖子效果的观察

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2016年第3期34卷 203-207页

作者：杨小迪孙希萌王旗崔洁计永胜薛洪宝胡守锋苏胖胖李江艳孟令文乔继琛丁忆晗宋迪吴琦方强陈兴智蚌埠医学院病原生物学教研室、安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠233030 首都医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室北京100069 安徽医科大学病原生物学教研室、安徽省人兽共患病重点实验室合肥230032 蚌埠医学院化学教研室蚌埠233030

目的观察金丝桃素对体外培养的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子的杀伤作用,探讨金丝桃素抗弓形虫的效果。方法将生理盐水(A组)和终浓度为5μg/ml(B组)、50μg/ml(C组)、500μg/ml(D组)的金丝桃素分别加入含弓形虫速殖子1×106... 详细信息

目的观察金丝桃素对体外培养的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子的杀伤作用,探讨金丝桃素抗弓形虫的效果。方法将生理盐水(A组)和终浓度为5μg/ml(B组)、50μg/ml(C组)、500μg/ml(D组)的金丝桃素分别加入含弓形虫速殖子1×106个/孔的24孔培养板中,于2、4、6 h后收集虫体,台盼蓝染色检测速殖子着色率,吉氏染色观察速殖子形态和结构变化,透射电镜观察速殖子超微结构的变化,流式细胞仪检测相同处理的携带黄色荧光蛋白的弓形虫的存活情况。结果弓形虫速殖子经不同浓度金丝桃素作用2 h后,B组、C组和D组虫体的台盼蓝着色率分别为(11.0±3.6)%、(25.0±6.3)%和(40.0±2.7)%,D组着色率高于C组和B组(P0.05)。作用4 h后,D组着色率为(97.0±2.0)%,高于C组(30.0±7.2)%、B组(20.0±3.0)%和A组(10.0±1.0)%(P速殖子存活率在金丝桃素作用后的各时间段内与对照组间差异有统计学意义(P速殖子效果,且随剂量增高和作用时间延长抗虫效果更明显。

关键词：金丝桃素刚地弓形虫速殖子体外效果

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刚地弓形虫速殖子的超微结构

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1989年第2期7卷 105-107页

作者：徐麟鹤王裕发陈聚梁徐志翔俞永富陶贤梅上海医科大学基础医学部寄生虫学教研室上海医科大学上海医科大学电镜室

弓形虫速殖子呈半月形或香蕉形,虫体表膜分两层。前端有极环和类锥体:极环由内膜增厚形成,类锥体则是一中空的圆锥状结构,它由斜向走行而排列整齐的纤丝组成。22根膜下微管起始于极环而分布至虫体后端。棒状体从类锥体向后延伸至核前沿... 详细信息

弓形虫速殖子呈半月形或香蕉形,虫体表膜分两层。前端有极环和类锥体:极环由内膜增厚形成,类锥体则是一中空的圆锥状结构,它由斜向走行而排列整齐的纤丝组成。22根膜下微管起始于极环而分布至虫体后端。棒状体从类锥体向后延伸至核前沿,其切面呈腺体样结构.棒状体可能具分泌功能.类锥体则与虫体侵入宿主细胞有关。

关键词：弓形体速殖子超微结构

刚地弓形虫速殖子与鼠星形胶质细胞体外共培养的实验观察

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2010年第4期28卷 318-320页

作者：李冬娜梁幼生周永华张焕相沈海英骆伟龚唯诸葛洪祥苏州大学独墅湖校区病原生物学系教研室苏州215123

原代培养星形胶质细胞,待其长至培养皿的80%时,将星形胶质细胞与弓形虫速殖子(细胞与虫体的比例为1∶10)共培养0～72h,吉氏染色观察星形胶质细胞和弓形虫速殖子的变化。共培养1h,此时定为0点,再培养0～48h,单磺酰戊二胺染色在荧光显微... 详细信息

原代培养星形胶质细胞,待其长至培养皿的80%时,将星形胶质细胞与弓形虫速殖子(细胞与虫体的比例为1∶10)共培养0～72h,吉氏染色观察星形胶质细胞和弓形虫速殖子的变化。共培养1h,此时定为0点,再培养0～48h,单磺酰戊二胺染色在荧光显微镜下观察星形胶质细胞内自噬囊泡的变化。结果发现共培养1h时,弓形虫速殖子开始进入星形胶质细胞,并出现荧光颗粒;8h星形胶质细胞内荧光颗粒最多;12h后显著减少,星形胶质细胞开始被破坏;48h星形胶质细胞内荧光颗粒消失;72h大部分星形胶质细胞已被涨破,留下大量增殖的弓形虫速殖子。说明自噬在弓形虫速殖子体外感染星形胶质细胞的过程中是受到抑制的。

关键词：星形胶质细胞弓形虫速殖子自噬

一氧化氮供体对弓形虫速殖子DNA含量的影响

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2001年第6期19卷 344-347页

作者：彭碧文胡建石赵蓉蒋明森林建银福建医科大学分子医学教研室武汉大学医学院寄生虫教研室武汉430071

目的　探讨亚硝基铁氰化钠 (SNP)对弓形虫速殖子DNA含量的影响。　方法　采用SNP与影响胞内 /胞外钙离子浓度的试剂作用于RH株刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)速殖子 ,流式细胞仪检测其DNA含量的变化。　结果　①SNP导致弓形虫速殖子DNA... 详细信息

目的　探讨亚硝基铁氰化钠 (SNP)对弓形虫速殖子DNA含量的影响。　方法　采用SNP与影响胞内 /胞外钙离子浓度的试剂作用于RH株刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)速殖子 ,流式细胞仪检测其DNA含量的变化。　结果　①SNP导致弓形虫速殖子DNA的损伤 ,并呈时间和剂量依赖性 ;② 2mmol/L胞外钙离子螯合剂EGTA ,2 5 μmol/L胞内钙离子螯合剂BAPTA/AM及 5 0 μmol/L钙离子拮抗剂verapamil单独处理弓形虫速殖子 ,其DNA含量与对照组相比无显著变化 ;③ 2mmol/LEGTA ,2 5 μmol/LBAPTA/AM及 5 0 μmol/Lverapamil明显减少 2mmol/LSNP所致的速殖子亚二倍体峰的比例。　结论　SNP通过改变弓形虫速殖子胞浆游离钙离子浓度 ,诱导其亚二倍体峰的出现。

关键词：刚地弓形虫速殖子亚硝基铁氰化钠一氧化氮 DNA含量流式细胞术

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弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系的建立

南方医科大学学报 2010年第4期30卷 668-671页

作者：丁洁琼吴焜谭峰陈晓光南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系广东广州510515

目的建立弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,按一定比例和条件接种于COS-7细胞内进行体外培养。分别在接种后第1、2、3、4、5、6天观察细胞和虫体的形态并提取TotalRNA,用RT-PCR的方法检测速殖子期特异性蛋白... 详细信息

目的建立弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,按一定比例和条件接种于COS-7细胞内进行体外培养。分别在接种后第1、2、3、4、5、6天观察细胞和虫体的形态并提取TotalRNA,用RT-PCR的方法检测速殖子期特异性蛋白SAG1基因、缓殖子期特异性蛋白BAG1基因和SAG2C基因的表达。结果随着速殖子在COS-7细胞中培养时间的延续,虫体的数量逐渐增多,但增殖速度逐步减缓;虫体在细胞内的排列方式也在不断变化,由成对的弧形、玫瑰花形或簇形、变成半圆形最后形成圆形的类包囊样结构。RT-PCR检测显示:速殖子期特异性蛋白SAG1基因在培养的第1～6天均有表达,且表达量呈递增趋势;缓殖子期特异性蛋白BAG1基因从第2天开始出现表达,随时间延续表达量逐渐增加;缓殖子期特异性蛋白SAG2C基因从第5天开始表达,第6天表达量增加。以上结果表明有越来越多的速殖子转化为缓殖子。改变培养条件,缓殖子也能向速殖子转化。结论成功构建弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转化体系,为其转化机制的研究奠定了基础。

关键词：刚地弓形虫体外培养速殖子缓殖子转化

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刚地弓形虫速殖子分离纯化方法的优化

中国兽医科学 2012年第5期42卷 467-472页

作者：王洁琳贾博寅王心蕊姜宁陈启军吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062

为减少弓形虫假包囊和宿主细胞对试验的干扰,对弓形虫的速殖子进行了分离纯化。将弓形虫RH株虫体复苏后,接种于小鼠腹腔进行培养,72h后收集腹液,腹液经27G注射器针头抽吸后进行不同组合的非连续密度梯度(1.031×106 mg/L、1.056×106 m... 详细信息

为减少弓形虫假包囊和宿主细胞对试验的干扰,对弓形虫的速殖子进行了分离纯化。将弓形虫RH株虫体复苏后,接种于小鼠腹腔进行培养,72h后收集腹液,腹液经27G注射器针头抽吸后进行不同组合的非连续密度梯度(1.031×106 mg/L、1.056×106 mg/L、1.077×106 mg/L、1.123×106 mg/L Percoll)离心纯化。通过显微镜观察以及细胞计数等方法比较各组合的纯化效果。结果显示,经注射器针头帮助假包囊破裂后,使用非连续密度梯度离心,以密度为1.056×106 mg/L、1.077×106 mg/L Percoll不连续梯度3 000r/min离心30min,可以将速殖子和假包囊进行较高纯度的分离纯化。本研究为纯化高纯度的弓形虫速殖子提供了一种方法。

关键词：刚地弓形虫速殖子假包囊分离纯化

弓形虫速殖子特异表达蛋白SAG1启动子的克隆及鉴定

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中国生物制品学杂志 2010年第6期23卷 602-604页

作者：安娜张瑞岩赵志远商立民刘全魏峰吉林农业大学生命科学学院长春130118 解放军军事医学科学院军事兽医研究所长春130062 长春祈健生物制品有限公司市场营销部长春130012

目的克隆弓形虫速殖子特异表达蛋白SAG1的启动子序列,为弓形虫基因操作提供工具。方法应用PCR方法扩增弓形虫速殖子特异表达蛋白SAG1的5′非编码区、致密颗粒蛋白GRA2的3′编码区和红色荧光蛋白(RFP)基因,并构建重组质粒pMD/SAG-RFP-GRA... 详细信息

目的克隆弓形虫速殖子特异表达蛋白SAG1的启动子序列,为弓形虫基因操作提供工具。方法应用PCR方法扩增弓形虫速殖子特异表达蛋白SAG1的5′非编码区、致密颗粒蛋白GRA2的3′编码区和红色荧光蛋白(RFP)基因,并构建重组质粒pMD/SAG-RFP-GRA,经电穿孔法将其转染弓形虫速殖子,倒置荧光显微镜观察RFP的表达。结果重组质粒pMD/SAG-RFP-GRA经双酶切和测序证明构建正确,质粒转染弓形虫速殖子24h,荧光显微镜下可观察到红色荧光,表明克隆的SAG1启动子具有转录活性。结论已成功克隆了弓形虫速殖子特异表达蛋白SAG1的启动子序列,并能介导外源基因在弓形虫体内的表达。

关键词：弓形虫病速殖子启动区(遗传学) 克隆