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葡萄质膜质子泵VvPMA1在盐碱胁迫条件下选择性剪接及作用机制

葡萄质膜质子泵VvPMA1在盐碱胁迫条件下选择性剪接及作用机制

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作者：赵攀齐鲁工业大学

学位级别：硕士

葡萄作为重要的经济作物其产业可持续发展受到土壤盐碱化严重束缚,有关其抗盐碱性研究开始受到关注。在盐碱土中,植物面对的是盐与碱交混的混合胁迫。植物在盐碱环境中最大限度调节pH恒稳态(Homeostasis)尤为关键。而位于根细胞质膜上... 详细信息

葡萄作为重要的经济作物其产业可持续发展受到土壤盐碱化严重束缚,有关其抗盐碱性研究开始受到关注。在盐碱土中,植物面对的是盐与碱交混的混合胁迫。植物在盐碱环境中最大限度调节pH恒稳态(Homeostasis)尤为关键。而位于根细胞质膜上的质子泵对此有重要作用。本研究中,我们用抗盐碱能力较强的克瑞森无核葡萄为材料,以根质膜质子泵家族成员为目标,探讨葡萄根质膜质子泵活性及调控方式随盐碱胁迫时间的变化,并从葡萄根中克隆了1个响应盐胁迫的基因VvPMA1,测序发现VvPMA1存在两种选择性剪接变体VvPMA1α和VvPMA1β,并对其两个剪接变体在植物生长发育和盐胁迫下的功能进行了探究,主要结果如下:1.50 mmol/L NaHCO(pH 8.0)处理克瑞森无核葡萄3 d,利用定量PCR技术比较了葡萄质膜H-ATPase基因家族各成员在葡萄根、茎、叶、果肉、果皮中的转录量,并筛选出在根中表达量高的VvPMA1基因。2.利用RT-PCR技术从葡萄根中克隆到VvPMA1基因全长。并通过测序发现VvPMA1存在两种变体VvPMA1α和VvPMA1β。对VvPMA1α和VvPMA1β核苷酸和蛋白一级结构进行生物信息学分析,显示其中VvPMA1α编码框共2862 bp,编码954个氨基酸残基,VvPMA1β编码框共2757 bp,编码919个氨基酸残基。因此,VvPMA1β比VvPMA1α编码框少105 bp,即35个氨基酸残基,而且位于蛋白的N末端。随后,与GenBank中葡萄参考基因组基因VvPMA1序列相比,VvPMA1β在VvPMA1 2号和3号外显子之间保留了长93 nt的内含子2,造成VvPMA1β通读框后移,因而编码出较短的N末端。进一步对VvPMA1上游顺式作用元件进行生物信息学分析,发现其中主要包括:ABRE、CGTCA-motif和WUN-motif,分别参与对脱落酸、茉莉酸甲酯(MeJA)及损伤的响应。3.使用酵母质膜H-ATPase缺失突变体RS-72进行功能互补验证克隆到的这两条基因的功能,发现VvPMA1β表达酵母的生长状态好于VvPMA1α表达酵母,而且增加了酵母突变体的pH生长范围。推测,VvPMA1β对H的运输能力高于VvPMA1α。4.对盐碱胁迫下葡萄根VvPMA1剪接变体的表达进行定量分析,发现VvPMA1β在盐碱胁迫3 h时转录量增加幅度最大,而VvPMA1α比对照明显降低。此时转录生成的总VvPMA1中VvPMA1β所占的比例增加,有利于提高N末端截短的高活性PM-H-ATPase的含量。随后在盐碱胁迫6 h-12 h时VvPMA1α转录量逐渐增加,VvPMA1β转录量逐渐降低,尽管VvPMA1β转录量仍然高于对照水平,但在总VvPMA1中所占的比例逐渐降低,势必会影响根质膜H-ATPase总活性。在胁迫2 d时VvPMA1β转录量明显低于对照,而VvPMA1α转录量与对照无明显差异(P>0.05)。此时VvPMA1β在总VvPMA1中所占的比例降低到对照水平以下。而且胁迫3 d后两个基因的转录量都明显低于对照。5.将VvPMA1编码区插入植物表达载体PRI-GFP中,并转化农杆菌LBA4404,侵染烟草叶片,利用共聚焦荧光显微镜对葡萄VvPMA1-GFP蛋白在烟草叶片细胞中进行亚细胞定位分析,结果显示VvPMA1-GFP蛋白位于细胞质膜上。6.将VvPMA1β插入植物表达载体PRI-GFP载体中,使用花序侵染法得到3株VvPMA1β转基因拟南芥阳性苗,对野生型和T代过表达拟南芥株系进行表型观察,发现与野生型拟南芥形态相比,转基因植株生长速率慢,侧根分支多,地上部分诱发丛生芽,且植株不易成活。7.利用农杆菌侵染法得到VvPMA1α和VvPMA1β转基因番茄阳性苗,发现VvPMA1α过量表达番茄与野生型在生长速率方面差异不显著,植株形态正常,相反,VvPMA1β过量表达番茄生长速率显著低于野生型和VvPMA1α过表达型,且植株呈现出不正常的生长,表现在茎弯曲,叶片皱缩,并且植株移栽不能成活。8.对VvPMA1α转基因番茄T代植株VvPMA1α-L2,VvPMA1α-L4,VvPMA1α-L7三个株系进行生理生化指标测定。结果表明,在正常环境条件下,VvPMA1α-L2,VvPMA1α-L4,VvPMA1α-L7植株生长速率显著高于野生型,且三个转基因株系均表现出与野生型不同的形态特征,与野生型相比,VvPMA1α-L2,VvPMA1α-L4,VvPMA1α-L7植株侧枝分支少,叶片不平展,向下弯曲程度高。利用酸碱指示剂溴甲酚紫进行根质子分泌试验,结果显示VvPMA1α转基因株系根部黄色面积更加明显,且范围大。说明VvPMA1α转基因株系根部周围pH更低,也间接反映出其根部质子分泌能力强于野生型植株。150

关键词：葡萄质膜质子泵(PM-H+-ATPase) 选择性剪接变体盐碱胁迫

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