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LvDscam介导的对虾获得性免疫识别及细胞吞噬的机理研究

LvDscam介导的对虾获得性免疫识别及细胞吞噬的机理研究

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作者：李桃萍浙江工商大学

学位级别：硕士

在过去的20年中,随着无脊椎动物抗病毒免疫防御机制的深入研究,越来越多的证据表明无脊椎动物除了有传统的先天性免疫防御系统,还存在着类似脊椎动物的免疫特异性防御系统。然而目前为止,对无脊椎动物免疫防御因子的研究还十分有限,获... 详细信息

在过去的20年中,随着无脊椎动物抗病毒免疫防御机制的深入研究,越来越多的证据表明无脊椎动物除了有传统的先天性免疫防御系统,还存在着类似脊椎动物的免疫特异性防御系统。然而目前为止,对无脊椎动物免疫防御因子的研究还十分有限,获得性免疫应答反应的机制还不甚清楚。在节肢动物中如果蝇、冈比亚按蚊、对虾、水蚤等,科学家们研究最多的免疫相关蛋白之一就是唐氏综合症细胞粘附分子Dscam。它在宿主中发挥着类似于模式识别受体的作用。目前发现它只有在节肢动物中才具有序列多样性,能针对不同的病原微生物通过选择性剪切产生不同的亚型,每一种亚型只能特异性的识别与其具有同源性的病原相关分子模式,从而特异性的与病原结合,引发宿主对病原微生物一系列的免疫反应。本课题组前期研究中发现递呈重组工程菌rVP28-bs免疫凡纳对虾后,用病原进行攻毒试验,对虾的存活率得到了显著的提高,而且免疫后的对虾能够特异性的抵抗WSSV病毒的感染。随后课题组在此基础上又深入到分子机制,以节肢动物中免疫相关的蛋白Dscam为目标,研究发现了口服重组菌株rVP28-bs免疫对虾后,Dscam能针对VP28产生免疫原特异性的可变剪接,随后课题组克隆并鉴定了特异性序列。鉴于此,本研究利用酵母双杂交技术进一步深入的验证VP28免疫刺激后LvDscam形成的可变区序列与VP28的结合特异性;利用RNA干扰技术验证LvDscam与对虾特异性吞噬WSSV的相关性。具体的研究成果如下： 1、利用酵母双杂交系统研究***-VP28诱导形成的LvDscam变构体库(可变结构域Ig2和Ig3)与VP28蛋白的相互作用,探究Dscam与免疫原结合的特异性。本次研究中合成了以下序列Ig2、Ig3原基因序列、VP28-Ig2、VP28-Ig3特异性变构体序列,以及新型特异性变构体vIg2序列,将这些序列作为猎物基因,连接到转录激活结构域pGADT7AD载体中;同时合成了VP28序列,将其作为诱饵基因连接到DNA结合结构域pGBKT7DNA BD载体中。将两种重组质粒穿梭载体同时导入到相应酵母菌中表达,并将杂交后的酵母菌涂于选择性培养基上。最后,5组有性杂交的酵母二倍体VP28+Ig2、VP28+Ig3、 VP28+VP28-Ig2、VP28+VP28-Ig3、VP28+vIg2和VP28+vIg2划线接种于最严格的四重缺陷培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA (QDO/X/A)上,都可以长出蓝色的菌落,表明这5组蛋白质之间都存在着相互作用。但是相比于阳性对照组P53+T的蓝色菌落,这5个实验组的菌落较少,颜色较浅,这可能由于蛋白质相互作用较弱而造成的。 2、利用RNA干扰技术沉默对虾Dscam基因,使其转录受到抑制,再用荧光定量PCR技术检测干涉的效果。本研究中以PBS缓冲液作为阴性对照组,与合成的两条siRNA序列共同注射凡纳对虾。然后分别在注射后的4、8、12、24、48、72和84h取虾的不同组织,提细胞总RNA进行Real-time PCR鉴定干涉效果。实验结果表明,合成的siRNA序列2具有较好的干涉效果,siRNA序列1干涉效果不明显。在注射Dscam-siRNA序列后12h左右,Dscam基因的转录开始受到明显抑制,在24h、48h和72h后,mRNA的表达水平都维持在很低的状态,直到84h后,转录抑制效果才开始逐渐恢复。这可能是由于体外合成的siRNA序列在宿主体内的不稳定性,逐渐被宿主降解,从而导致干涉效果减弱。 3、利用RNA干扰技术沉默LvDscam基因,同时以不具有沉默特性的control-siRNA序列作为对照,研究不同处理组对虾对WSSV刺激的吞噬活性的差异。以此验证***-VP28诱导细胞特异性吞噬WSSV的过程中Dscam的介导作用。研究结果表明对虾对WSSV的吞噬百分比随着干涉作用的强弱而变化。当Dscam基因表达被抑制时,吞噬百分比也随着降低;当抑制解除时,吞噬百分比也随之逐渐升高。说明Dscam介导了对虾的特异性吞噬过程,在对虾抗病毒过程中发挥着一定的作用。同时用Dscam-siRNA序列分别注射rVP28-bs免疫后的对虾和对照组PBS处理过的对虾,同时以control-siRNA序列分别注射两种对虾作为阴性对照。发现rVP28-bs实验组对WSSV的吞噬活性受RNAi沉默Dscam的影响显著。说明LvDscam在VP28免疫后的对虾在特异性吞噬WSSV过程中发挥着重要的作用。

关键词：对虾白斑综合征病毒(WSSV) 唐氏综合症细胞粘附分子(Dscam) 选择剪切重组菌株rVP28-bs 酵母双杂交 RNA干扰细胞吞噬荧光定量PCR

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