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猪瘟病毒Shimen株E2基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

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中国兽医学报 2006年第3期26卷 238-239,242页

作者：刘建玲苏正元许信刚李谱华张彦明西北农林科技大学动物科技学院西北大学生命科学学院陕西西安710069

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Shimen株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5′端分别加上EcoR和BamH位点,以CSFV-Shimen株脾毒为材料,一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增出约1.2kb的E2基因。将PCR产物回收后与pMD18-T载体连接并转化,经PCR和酶切鉴定获得重组质粒E2-T。将E2-T经EcoR和BamH酶切消化、回收目的基因后,与经BamH/EcoR酶切的逆转录病毒载体pBABE-puro连接并转化,经酶切鉴定获得重组质粒pBABE-puro-E2。序列测定表明,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。

关键词：猪瘟病毒 E2基因 RT—PCR 逆转录病毒表达载体

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

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世界华人消化杂志 2005年第6期13卷 760-765页

作者：高巍周永兴张惠中聂青和中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊治中心陕西省西安市710038 中国人民解放军第四军医大学唐都医院中心实验室陕西省西安市710038

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克... 详细信息

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

关键词： TGF-β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体逆转录病毒载体可溶性重组DNA技术 PA317细胞 PCR方法病毒滴度测定基因治疗肝纤维化 TβRⅡ 重组质粒人IgG1 pLXSN 脂质体介导限制性酶切构建表达融合蛋白目的基因产物纯化

抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装

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第四军医大学学报 2001年第3期22卷 280-282页

作者：程虹刘彦仿张惠中于继云张素珍第四军医大学基础部病理学教研室陕西西安710033 第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所

0　引言　人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验，同时，逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法［1］. 迄今所掌握的研究资料表明... 详细信息

0　引言　人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验，同时，逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法［1］. 迄今所掌握的研究资料表明，接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应. 因此，我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN，将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因（sFv-TNF-α）克隆至该载体，进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.

关键词：肝癌单链双功能抗体逆转录病毒表达载体基因治疗

mM-CSF及其剪切体重组逆转录病毒表达载体的构建

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山东医药 2015年第31期55卷 5-7页

作者：马翠花廖金凤王大刚刘淑艳任倩郑国光秦皇岛市第一医院河北秦皇岛066000 中国医学科学院血液学研究所血液病医院

目的构建膜结合型M-CSF(mM-CSF)及其胞内区截短30个氨基酸的剪切体(mM-CSF-Δ)重组逆转录病毒表达载体。方法用DNA重组技术构建并鉴定mM-CSF和mM-CSF-Δ的重组逆转录病毒表达载体MSCVPGK-GFP-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ,与空载体对... 详细信息

目的构建膜结合型M-CSF(mM-CSF)及其胞内区截短30个氨基酸的剪切体(mM-CSF-Δ)重组逆转录病毒表达载体。方法用DNA重组技术构建并鉴定mM-CSF和mM-CSF-Δ的重组逆转录病毒表达载体MSCVPGK-GFP-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ,与空载体对照MSCV-PGK-GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒,并感染HEK293细胞,通过流式分选术获得3种阳性细胞。结果经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染HEK293细胞,获得了稳定表达细胞株HEK293-M、HEK293-M-Δ和对照细胞株HEK293-V。RT-PCR以及Western blotting法检测发现HEK293细胞中有mM-CSF和mM-CSF-Δ的表达,HEK293-M细胞和HEK293-M-Δ细胞经流式抗体标记后均能检测到膜蛋白的表达。结论成功构建了mM-CSF及其剪切体的重组逆转录病毒表达载体。

关键词： mM-CSF 剪切体逆转录病毒表达载体 HEK293细胞系

AC133-2分子的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

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苏州大学学报（医学版） 2005年第1期25卷 31-33页

作者：王明元居颂光居颂文狄文英周晓华薛群曲静方振羊张学光苏州大学医学生物技术研究所江苏省干细胞研究重点实验室江苏苏州215007 苏州市红十字中心血站江苏苏州215006

目的克隆人AC133-2全长基因,构建PGEZ-Term-AC133—2逆转录病毒表达载体。方法采用分段克隆的方法,通过聚合链式反应从胎肝文库中克隆AC133-2,并构建AC133—2基因的逆转录病毒表达载体。结果成功克隆AC133—2全长基因并构建PGEZ-Term-AC... 详细信息

目的克隆人AC133-2全长基因,构建PGEZ-Term-AC133—2逆转录病毒表达载体。方法采用分段克隆的方法,通过聚合链式反应从胎肝文库中克隆AC133-2,并构建AC133—2基因的逆转录病毒表达载体。结果成功克隆AC133—2全长基因并构建PGEZ-Term-AC133-2逆转录病毒表达载体。结论AC133-2全长基因克隆及构建逆转录病毒表达载体的成功,为构建AC133-2转基因细胞和制备抗人AC133-2单克隆抗体和研究AC133-2的生物学功能奠定了物质基础。

关键词： AC133—2基因逆转录病毒表达载体

抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建

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广州医学院学报 2007年第2期35卷 58-61页

作者：谢晓斌刘启才张雅洁广州医学院病理教研室广东广州510182 广州医学院实验医学研究中心广东广州510182

目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C。方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN... 详细信息

目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C。方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定。结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确。结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C。

关键词： RNA干扰短发夹RNA 血管内皮生长因子C 逆转录病毒表达载体

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反义bcl-2逆转录病毒表达载体的构建

湖北广播电视大学学报 2010年第12期30卷 154-155页

作者：王羽福州教育学院福建福州350001

凋亡是一种不同于坏死且受基因控制的主动性细胞自我消亡过程,亦是许多抗癌药物作用的主要机理之一。Bcl-2是一种凋亡负控制的重要基因,其蛋白产物能抑制细胞的凋亡或程序性细胞死亡过程。我们构建了反义bcl-2逆转录病毒表达载体导入多... 详细信息

凋亡是一种不同于坏死且受基因控制的主动性细胞自我消亡过程,亦是许多抗癌药物作用的主要机理之一。Bcl-2是一种凋亡负控制的重要基因,其蛋白产物能抑制细胞的凋亡或程序性细胞死亡过程。我们构建了反义bcl-2逆转录病毒表达载体导入多发性骨髓瘤细胞株来调节Bcl-2基因表达,从而诱导细胞凋亡或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性,来探讨与多发些骨髓瘤的关系。

关键词：凋亡 Bcl-2基因逆转录病毒表达载体

抗人TGF_α发夹状核酶基因逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

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第四军医大学学报 1998年第1期19卷 12-14页

作者：赵锦荣惠宏襄金明王成济第四军医大学基础部生物化学及分子生物学教研室

目的：构建抗人ＴＧＦα核酶基因逆转录病毒表达载体．方法：用二异丙基亚磷酰胺法合成抗人ＴＧＦα核酶基因的两条互补单链，将其退火后克隆人ｐＵＣ１８，用ＥｃｏＲＩ及ＢａｍＨＩ切下该基因，定向克隆人逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲ... 详细信息

目的：构建抗人ＴＧＦα核酶基因逆转录病毒表达载体．方法：用二异丙基亚磷酰胺法合成抗人ＴＧＦα核酶基因的两条互补单链，将其退火后克隆人ｐＵＣ１８，用ＥｃｏＲＩ及ＢａｍＨＩ切下该基因，定向克隆人逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲ．结果：酶切后经琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，所构建重组克隆载体ｐＵＣ１８ＴＲＺ及重组表达载体ｐＤＯＲＴＲＺ正确．结论：成功构建了抗人ＴＧＦα发夹状核酶基因逆转录病毒表达载体，为下一步运用核酶对肿瘤进行基因治疗打下了基础．

关键词：转化生长因子α 发夹状核酶逆转录病毒表达载体

人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

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中国肿瘤 2006年第1期15卷 43-46页

作者：陈秀军程玉峰王来城山东大学齐鲁医院山东济南250012 山东省立医院医学科研中心山东济南250021

[目的]构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体,建立高表达bax基因的Hela细胞。[方法]通过RT-PCR方法从Hela细胞克隆bax基因,根据基因工程原理,经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSN-I... 详细信息

[目的]构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体,建立高表达bax基因的Hela细胞。[方法]通过RT-PCR方法从Hela细胞克隆bax基因,根据基因工程原理,经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSN-IRES2-EGFP,转染Hela细胞后,荧光显微镜和WesternBlotting检测bax基因的表达情况。[结果]成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体,并将其转入Hela细胞。[结论]成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株,为探讨bax基因与放射敏感性之间的关系奠定了基础。

关键词： bax基因逆转录病毒表达载体 IRES序列载体构建