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微生物学通报 2024年第12期51卷 4854-4868页

作者：刘婷婷刘嘉琪刘洋卞小莹山东大学微生物技术国家重点实验室

反转录子(retron)主要是由非编码RNA和逆转录酶所组成的参与抗噬菌体防御系统的细菌遗传元件。基于retron能产生多拷贝单链DNA的特性，将其与同源重组蛋白或CRISPR/Cas蛋白相结合已经在细菌和酵母中实现高效精准的基因编辑，而不依赖于... 详细信息

反转录子(retron)主要是由非编码RNA和逆转录酶所组成的参与抗噬菌体防御系统的细菌遗传元件。基于retron能产生多拷贝单链DNA的特性，将其与同源重组蛋白或CRISPR/Cas蛋白相结合已经在细菌和酵母中实现高效精准的基因编辑，而不依赖于外源DNA的直接引入。Retron系统经过不同优化，可应用于突变子文库构建、分子记录仪、蛋白连续进化等多个方向。本文首先介绍了retron的结构与分子机制，重点总结了基于retron的基因编辑技术在细菌和真菌中的应用，并对其优势和限制因素进行分析。最后对基于retron的基因编辑技术的未来发展进行了展望。

关键词：反转录子逆转录元件微生物基因编辑重组工程 CRISPR/Cas

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SAMHD1 N末端恢复蛋白功能的机制研究

SAMHD1 N末端恢复蛋白功能的机制研究

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作者：赵梓含吉林大学

学位级别：硕士

SAMHD1(SAM and HD domain containing protein 1)是人体细胞中首个被发现的d NTP水解酶,也是固有免疫系统中重要的免疫调节因子和抗病毒因子。自2000年被正式报道以来,SAMHD1被发现在细胞周期调控、癌症发生发展、病毒感染抑制等很多... 详细信息

SAMHD1(SAM and HD domain containing protein 1)是人体细胞中首个被发现的d NTP水解酶,也是固有免疫系统中重要的免疫调节因子和抗病毒因子。自2000年被正式报道以来,SAMHD1被发现在细胞周期调控、癌症发生发展、病毒感染抑制等很多方面都发挥着重要作用。目前的研究成果认为,SAMHD1蛋白C末端是执行其功能的主要部分;与之相对的是,SAMHD1蛋白N末端除携带有核定位信号外并无其它已知功能。为了考察SAMHD1 N末端对于SAMHD1蛋白功能的影响,本论文经过系统的研究,得到以下结论:1.N末端片段的存在影响SAMHD1抑制LINE-1逆转座活性的能力SAMHD1蛋白可有效抑制逆转录元件LINE-1的复制活性,并借此调节固有免疫激活水平,抑制癌症的发生发展。因此,深入解析SAMHD1蛋白调控LINE-1活性的分子机制是十分必要的。然而,在确证已报道机制的同时,我们意外发现,在N末端加上m Cherry标签后可以使本已失去LINE-1抑制能力的SAMHD1 120突变体恢复对LINE-1活性的调控功能。进一步的研究表明,N-m Cherry-SAMHD1120确实可以有效下调LINE-1 ORF2p的表达水平,而这也是野生型SAMHD1蛋白调控LINE-1活性的主要分子机制。值得注意的是,m Cherry与SAMHD1蛋白自身N末端在氨基酸序列上存在较大的差异。这暗示对于SAMHD1蛋白的N末端来说,其存在本身(而非特异性序列)可能就是SAMHD1蛋白发挥全部或部分功能所必需的。2.N末端片段的存在决定SAMHD1可否受Vpx蛋白下调Vpx介导SAMHD1蛋白通过蛋白酶体途径降解是HIV-2和SIV突破SAMHD1抗病毒防线的主要机制,而SAMHD1 120则不再受到Vpx蛋白的下调作用。为了进一步验证SAMHD1 N末端对于蛋白功能有重要影响的这一假说,本研究考察了N-m Cherry-SAMHD1 120被Vpx蛋白介导降解的情况。结果发现,N-m Cherry-SAMHD1 120和N-EGFP-SAMHD1 120都可以被Vpx降解,不仅说明N末端片段的存在是Vpx降解SAMHD1蛋白的必要条件,同时也证明该现象对SAMHD1蛋白的N末端序列没有特异性上的要求。更深入的研究发现,Vpx对SAMHD1 120和N-m Cherry-SAMHD1 120都具有识别作用,但只会介导后者发生多聚泛素化。这些结果提示,在Vpx介导的SAMHD1蛋白降解过程中,SAMHD1蛋白的N末端片段极可能通过在空间上的延伸拉近了与泛素连接酶的距离,同时也提供了可被泛素化的氨基酸位点。综上所述,SAMHD1蛋白的N末端对于蛋白调控LINE-1活性已经被Vpx介导降解来说都是十分重要的。这种重要性来自于N末端片段存在本身,而非其序列特异性,说明N末端片段在空间上的占位对于SAMHD1蛋白的部分功能必不可少。相关结果以及后续研究将促进人们对SAMHD1蛋白及其功能机制的理解;而若能实现空间上的阻隔,则有望阻断Vpx对SAMHD1的降解作用,从而为研发新型艾滋病治疗方法提供分子靶点与理论基础。

关键词： Vpx SAMHD1 LINE-1 HIV 逆转录元件

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