检索结果-南通市图书馆

粮食与油脂 2018年第12期31卷 88-91页

作者：李响南京中医药大学第二临床医学院江苏南京210023

将赭曲霉毒素A(OTA)适配子与Fe3O4磁性纳米粒子结合,CdTe发光量子点标记于OTA适配子互补短链上,结合荧光分析技术、适配子识别技术与磁分离富集技术,建立一种OTA的高特异性和灵敏性的新型检测技术。

关键词： CdTe量子点荧光探针适配子免疫分析

适配子磁性微球结合多重PCR检测Listeria monocytogenes

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适配子磁性微球结合多重PCR检测Listeria monocytogenes

作者：李姗姗华中农业大学

学位级别：硕士

适配子磁性微球是将特异性适配子与磁性微球相连接,适配子可以与靶物质特异性结合,利用磁性微球在外加磁场的作用下即可使靶物质与周围介质分离,从而实现分离富集靶物质的目的,此方法不仅操作简单而且灵敏度高。多重PCR法是在一个扩增... 详细信息

适配子磁性微球是将特异性适配子与磁性微球相连接,适配子可以与靶物质特异性结合,利用磁性微球在外加磁场的作用下即可使靶物质与周围介质分离,从而实现分离富集靶物质的目的,此方法不仅操作简单而且灵敏度高。多重PCR法是在一个扩增体系中加入多对引物,同时扩增出多个核酸片段,具有快速、灵敏度高、特异性强等特点。将适配子磁性微球分离与多重PCR结合可以兼具两者的优势,实现单增李斯特菌的快速、准确检测。本研究在已经筛选得到单增李斯特菌适配子的基础上,将适配子固定于磁性微球表面,制成适配子磁性微球用于富集单增李斯特菌。结合多重PCR法建立一种快速检测单增李斯特菌的方法。主要研究内容及研究结果如下。1.聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球的制备采用共沉淀法制备四氧化三铁磁性纳米粒子,比较了柠檬酸钠、PEG-20000、PEG-4000及油酸4种分散剂,发现油酸作为分散剂时磁性微球的粒径均匀、分散性好。油酸修饰四氧化三铁的最佳条件为氨水添加量25 mL,油酸添加量3 mL,反应时间1 h。采用乳液聚合法制备了核壳型聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球,经TEM、XRD、FT-IR、VSM对四氧化三铁磁性微球、油酸修饰四氧化三铁磁性微球、聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球进行表征,结果显示制备的磁性微球纯度较高,为单一相的四氧化三铁,立方晶系,分散性良好,聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球的饱和磁化强度为49.5 emu/g且为超顺磁性。电导滴定法测得聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球表面生成的氨基含量为2.14 mmol/g,为连接链霉亲和素提供活性基团。2.适配子磁性微球富集单增李斯特菌采用共价结合法将链霉亲和素结合到聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球的表面,制备链霉亲和素磁性微球。竞争结合法测得链霉亲合素磁性微球与生物素及生物素标记的适配子的结合能力分别为7.58 nmol/mg和0.14 nmol/mg。链霉亲和素磁性微球与生物素标记的单增李斯特菌适配子相连制得适配子磁性微球,用于富集单增李斯特菌。适配子磁性微球在最佳捕获条件下,100μL单增李斯特菌菌液中(103CFU/mL)加入0.05 mg适配子磁性微球,孵育150 min,平板计数法测得对单增李斯特菌的捕获效率为65%。3.适配子磁性微球分离结合多重PCR检测单增李斯特菌本研究比较了 12对引物,确定iap6作为李斯特菌属特异性引物,hly1作为单增李斯特菌种特异性引物,用于多重PCR检测。经过DNA提取方法、PCR反应体系的引物浓度和退火温度的优化,建立检测单增李斯特菌的多重PCR。该方法可以检测到0.015 ng的单增李斯特菌DNA。同时本研究在富集到的菌液中加入PMA,特异性地提取活细胞DNA,避免了假阳性结果。102 CFU和103 CFU单增李斯特菌人工污染食品样品,增菌培养后多重PCR检出时间分别为6h、4h,而经磁性微球富集后再进行多重PCR的检出时间分别为4 h、2 h。表明该方法可以简化样品处理过程,缩短检测时间。

关键词：单增李斯特菌磁性微球适配子多重PCR

新型“适配子—脂质体”siRNA靶向入胞递送系统的构建及其应用于前列腺癌治疗的实验研究

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新型“适配子—脂质体”siRNA靶向入胞递送系统的构建及其应用于...

作者：王啸林广西医科大学

学位级别：硕士

前列腺癌是目前男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率逐年上升也严重影响男性健康。早期诊断和手术切除是目前治疗前列腺癌较为有效的方法,但是手术切除治疗效果有限。随着近年来生物化学与分子生物学的快速发展,如何在分... 详细信息

前列腺癌是目前男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率逐年上升也严重影响男性健康。早期诊断和手术切除是目前治疗前列腺癌较为有效的方法,但是手术切除治疗效果有限。随着近年来生物化学与分子生物学的快速发展,如何在分子水平去认识和治疗疾病逐渐成为人们关注的焦点,人们认识到只有从肿瘤的发生发展机制方面来治疗恶性肿瘤,才是彻底根治的唯一途径。因此,研究探索新型、安全、高效的前列腺癌基因治疗方法具有十分重要的临床意义和应用价值。目前常用于基因治疗研究及临床应用的载体主要分为病毒载体和非病毒载体,病毒载体由于其潜在的致病性、免疫原性及大规模生产制备困难等缺点,使其应用受到局限。非病毒载体优点包括毒性低,制备方法简单等,但存在转染效率低,靶向性差等问题。因此设计高靶向性的低毒高效的递送系统是当前抗肿瘤研究的热点之一。本课题针对前列腺癌基因治疗时体内递送的难题,从靶向递送和安全包裹两方面着手--采用新型转录方法制备具有特异性识别前列腺特异性膜抗原（PSMA）的寡核苷酸适配子,并对其进行化学修饰,用反向蒸发等技术制备脂质体用以包裹有确切沉默效果的siRNA,然后通过特异的合成方法将寡核苷酸适配子和脂质体-siRNA二者有机结合,从而构建可特异性识别PSMA的新型“适配子-脂质体”siRNA体内靶向入胞递送系统。通过透射电镜及激光粒度仪对于递送系统的形态学及理化性质进行测定;以PSMA特异性抗体为阳性对照,进一步通过流式细胞术考察递送系统靶向性及与靶细胞的亲和性,使用Plk-1作为靶基因,体外细胞水平全面评价该系统的稳定性、靶向性与有效性,通过荧光显微镜观察适配子-脂质体-siRNA复合物的入胞效率,RT-PCR测定靶基因的沉默效应。研究结果显示,首先,成功构建了脂质体-siRNA复合物,其粒径为117±4.3nm, Zeta电位为47±3.6mV;成功改进了RNA适配子的转录方法,与传统方法相比,转录效率提高约100倍;成功对适配子进行化学修饰,并证明修饰后转录效率无明显降低;通过“后插入法”成功将适配子与脂质体-siRNA复合物进行偶联,制备适配子-脂质体-siRNA复合物,其粒径为151±6.1nm,Zeta电位为40±5.8mV;所制备适配子-脂质体-siRNA复合物具有较高靶向性及亲和性,且亲和性强于PSMA特异性抗体;荧光显微镜观察递送系统转染效率高于商品化脂质体,RT-PCR结果显示沉默效率较高。上述结果表明,成功构建了新型“适配子-脂质体”siRNA靶向入胞递送系统,同时具有较高的细胞靶向性及基因沉默效率,为siRNA的体内应用及前列腺癌的治疗提供理论和实验依据,同时为恶性肿瘤的靶向基因治疗提供新的思路。

关键词：脂质体 siRNA 适配子 PSMA

SELEX:一种体外筛选核酸适配子的新技术

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国外医学（分子生物学分册） 2001年第2期23卷 126-128页

作者：甄蓓第一军医大学流行病学教研室广州510515

SEL EX技术是一项新的体外筛选技术 ,它是用体外合成的、其库容为 1 0 1 5左右的随机寡核苷酸库与靶物质结合 ,通过数轮的筛选与扩增 ,筛选到靶物质的目的 DNA或 RNA片段 ,对疾病的诊断与治疗方面起着重要的作用 ,为核酸的结构和功能的... 详细信息

SEL EX技术是一项新的体外筛选技术 ,它是用体外合成的、其库容为 1 0 1 5左右的随机寡核苷酸库与靶物质结合 ,通过数轮的筛选与扩增 ,筛选到靶物质的目的 DNA或 RNA片段 ,对疾病的诊断与治疗方面起着重要的作用 ,为核酸的结构和功能的研究。

关键词： SELEX 寡核苷酸库适配子体外筛选

188Re标记U87-EGFRvⅢ细胞的适配子在胶质瘤动物模型中的作用

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188Re标记U87-EGFRvⅢ细胞的适配子在胶质瘤动物模型中的作用

作者：伍锡栋南方医科大学

学位级别：硕士

指数级富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)是一种针对靶分子筛选得到高亲和力、特异性强的核酸配基的体外筛选技术,由美国的Gold和Ellington在1990年建立。以完整细胞为靶标的C... 详细信息

指数级富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)是一种针对靶分子筛选得到高亲和力、特异性强的核酸配基的体外筛选技术,由美国的Gold和Ellington在1990年建立。以完整细胞为靶标的Cell-SELEX技术可以在靶细胞的分子组成未知的情况下筛选得到适配子(aptamer)。Cell-SELEX技术是在SELEX技术的基础上发展来的,大大提高了筛选的效率和靶标的范围。目前这种技术在肿瘤研究中的应用日益广泛,可用于肿瘤的诊断和治疗。应用Cell-SELEX技术可以筛选出特异结合肿瘤细胞的适配子,因此Cell-SELEX技术在基础研究、临床诊断和疾病治疗等方面具有广泛的应用。胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤,由于肿瘤呈浸润性生长,传统治疗方法包括手术切除、放疗和化疗,其效果极为有限,神经胶质瘤在颅内各种肿瘤中最为多见。据报道胶质瘤发病率占所有脑肿瘤的70%,其中多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM)是最常见的脑肿瘤,其预后极差,5年存活率不到3%。胶质瘤很难根治,往往会复发。由于传统的外科手术切除、放射治疗和化疗等治疗方法,受到放化疗抗性、血脑屏障对药物不通透等多种因素的影响,疗效受到明显的限制,因此对胶质瘤的靶向治疗的研究具有重要意义。EGFRⅧ是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)胞外区2-7个外显子(EGFRA2-7)缺失导致的突变体,与肿瘤的侵袭性和致瘤性有关。EGFRvIII在正常细胞中不表达,仅存在于恶性的肿瘤细胞,在正常组织中不表达,因而是一个很好的肿瘤治疗靶标,用Cell-SELEX技术筛选针对过表达U87-EGFRvIII细胞的适配子对胶质瘤靶向治疗研究有重要意义,而且使用的Cell-SELEX技术具有简便、快速、经济等特点。适配子具有分子小、快速的血浆清除率、高组织穿透力、免疫原性低、稳定性好等特点,文献报道适配子可有效地应用于靶向治疗、检测和诊断等。2005年第一个适配子的药物"Mucagen"已经被美国FDA批准上市,另外针对核仁蛋白的AS1411等适配子也在临床试验中,这些都表明适配子在疾病治疗中作用。随着SELEX技术的进展,它已经成为了生命科学研究和医药研究中越来越重要的研究工具,因此应用Cell-SELEX技术对胶质瘤细胞的靶标筛选和研究对胶质瘤的临床诊断、治疗及肿瘤基础研究具有很大的应用价值和前景,通过筛选得到的特异性适配子也将成为基础研究和应用研究中有效的分子识别工具。本实验研究主要从三方面研究：一是在细胞水平上筛选针对U87-EGFRvIII细胞的适配子及其结合特异性鉴定;二是在裸鼠动物荷瘤模型上初步观察筛选得到的适配子U2对肿瘤生长的抑制作用;三是188Re标记适配子在体内的代谢情况和靶向性治疗研究。 (1)通过应用Cell-SELEX技术针对靶细胞U87-EGFRvIII筛选适配子。在第4轮开始引入反筛细胞U87MG,应用消减SELEX技术筛选适配子。在筛选适配子过程中严格地按照一定的比例投入文库的量,在每一次投入的次文库都要经过尿素胶鉴定。在洗涤细胞时随着筛选轮数的不断增加,洗涤时间和洗涤次数也逐渐的增加,文库与细胞的孵育时间也逐渐的减少。我们利用PCR技术扩增双链dsDNA,通过链霉亲和素磁珠分离法分离单链ssDNA,得到带FITC的单链ssDNA作为下次筛选的文库。PCR过程中需要对反应体系和各种试剂的反应量进行梯度摸索,最后确定为条带单一、纯度高、分子量为76bp的为目的条带,结果表明PCR扩增得到的双链dsDNA和磁珠分离法得到的单链ssDNA均为条带单一、纯度高的分子量为76bp目的条带,如此循环共进行11轮筛选,然后进行克隆和测序。利用在线软件分析序列同源性,找到了四条同源性一致的序列作为筛选得到的适配子,分别命名为适配子U2、U8、U19和U31。其次,通过公司合成5’端标记的FITC适配子U2、U8、U19和U31并对其鉴定,FITC标记的原库GN作为检测的对照适配子。通过流式细胞检测仪检测结合寡核苷酸的随着筛选轮数增加的富集情况;经过蛋白酶K分别3min和10min不同程度消化细胞后来观察适配子与靶细胞U87-EGFRvIII结合的强度变化。结果发现：随着筛选轮数的增加,结合的寡核苷酸有富集作用;流式细胞检测仪检测到适配子与靶细胞U87-EGFRvIII结合的峰位比空白对照和原库GN对照的峰往右偏移,表明有富集作用。由于蛋白酶K会破坏细胞膜表面,因此对细胞进行不同程度的蛋白酶K消化,蛋白酶K对细胞消化3min和10min的不同程度后,对适配子与靶细胞U87-EGFRvIII的结合强度有一定的影响,随着消化时间的增加,对结合强度的影响越大,即峰的位置往左

关键词： U87-EGFRvⅢ Cell-SELEX 适配子裸鼠荷瘤模型 188Re

稻曲菌素A适配子的筛选及pH可视化核酸探针的构建

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稻曲菌素A适配子的筛选及pH可视化核酸探针的构建

作者：刘梦婷华中师范大学

学位级别：硕士

稻曲病作为最主要的水稻真菌病害之一,严重威胁作物产量和食品安全。该病害能以真菌孢子的形式通过空气在田间传播,因此早期诊断对于稻曲病的有效控制至关重要。稻曲病的发生、发展过程中会伴随真菌毒素Ustiloxins的产生,在发病早期以Us... 详细信息

稻曲病作为最主要的水稻真菌病害之一,严重威胁作物产量和食品安全。该病害能以真菌孢子的形式通过空气在田间传播,因此早期诊断对于稻曲病的有效控制至关重要。稻曲病的发生、发展过程中会伴随真菌毒素Ustiloxins的产生,在发病早期以UstiloxinA为主。因此,UstiloxinA高灵敏检测可能实现稻曲病的早期诊断。核酸适配子具有与靶标特异性结合的能力,已经发展成为一类重要的检测和诊断工具。SELEX筛选技术则是获得靶标适配子的主要途径,利用该方法已经成功筛选得到大量包括真菌毒素在内的适配子。以适配子为信号检测元件设计基于滚环扩增技术（RCA）的可视化传感器,能通过DNA扩增放大检测信号,并得到直观的测试结果。筛选UstiloxinA的适配子、设计高灵敏的可视化核酸传感器,对于最终实现稻曲病的早期诊断具有重要意义。我们主要从以下两个方面进行了系统研究:1.利用高纯度的靶标化合物Ustiloxin A,通过基于磁珠的SELEX筛选技术（Mag-SELEX）,经14轮正筛、负筛与反筛（谷胱甘肽、甘氨酸和Ustiloxin D）,我们获得了与Ustiloxin A作用的motif序列;通过深入分析发现,Ustiloxin A偏向于和包含GATGG、GAGACCATC、CTCAGATG结构单元的DNA作用。根据所得的motif序列,我们设计了能与Ustiloxin A结合的DNA序列P1-P3,靶标与DNA的结合强度随筛选轮数的增加而增强。2.以蛋白质PDGF-BB和其适配子为模型,我们设计了能与适配子竞争性结合的CDNA,用以启动RCA扩增;RCA产物能与脲酶（Urease）偶联的DNA结合,并催化显色底液中的尿素水解为氨气,使溶液pH增加,导致底液中酚红指示剂变红。经优化后,该传感器的背景信号干扰较小,能实现靶标PDGF-BB的高灵敏检测;12 pmol PDGF-BB能使体系变为显著的红色,且该传感器对靶标的检测具有特异性。综上所述,我们利用固定靶标的Mag-SELEX筛选获得了与UstiloxinA结合的motif序列,设计了一类基于RCA的pH可视化核酸传感器。本文对设计以Ustiloxin A为靶标的可视化核酸传感器、开发稻曲病的早期诊断工具都具有一定参考价值。

关键词：稻曲菌素A 适配子基序序列体外指数富集的配体系统进化技术滚环扩增技术可视化核酸传感器

针对青霉素结合蛋白2a适配子筛选及初步应用

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针对青霉素结合蛋白2a适配子筛选及初步应用

作者：马洪玉第二军医大学

学位级别：硕士

[目的] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)所致的医院感染率逐年上升,青素结合蛋白2a(PBP2a)作为其主要耐药机制,已成为全球抗MRSA关注的热点和方向。本研究以重组蛋白PBP2a转肽酶区为靶标,筛选与其高特异性、高亲和力结合的适配子。并利... 详细信息

[目的] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)所致的医院感染率逐年上升,青素结合蛋白2a(PBP2a)作为其主要耐药机制,已成为全球抗MRSA关注的热点和方向。本研究以重组蛋白PBP2a转肽酶区为靶标,筛选与其高特异性、高亲和力结合的适配子。并利用筛选出的适配子建立快速检测PBP2a的方法。 [方法] 1.本研究将PBP2a转肽酶区基因片段通过PCR扩增,构建原核表达载体,经双酶切和测序鉴定后,诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)plys中表达,应用Ni-IDA预装柱纯化重组蛋白,用Western-blot鉴定。 2.构建长度为96nt的随机ssDNA文库,两端为18nt的固定序列,中间60nt为随机序列,库容量大约为1016。以PBP2a转肽酶区为靶标,利用配体指数增强系统进化(SELEX)技术,筛选出针对PBP2a转肽酶区的适配子群。 3.将第13轮筛选产物进行扩增、纯化、TA克隆、测序并用相关软件分析其一级和二级结构。 4.以胶体金标记适配子,建立斑点渗滤法用于检测适配子的特异性。以地高辛—抗地高辛抗体—碱性磷酸酶系统作为桥连测定不同浓度的适配子与靶蛋白的结合力,通过软件获得解离常数Kd值,进一步鉴定了适配子与靶蛋白的亲和力。 [结果] 1.重组表达载体经BamH I、EcoR I酶切,电泳图显示在1000bp处有明显条带,测序结果基本与基因库登录的目的片段序列相同,无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定,在分子量38KD处均可见一新生蛋白条带,与PBP2a转肽酶区的分子量相吻合,说明已成功诱导了PBP2a转肽酶区蛋白。 2.随着筛选轮数的增加,PBP2a与ssDNA富集库的结合力也显著增高。13轮后结合力从最初的2.9%上升至40.4%,并维持一个稳定状态。 3.第13轮产物进行克隆测序,利用ClustalX和Mega5软件分析序列的一级结构,显示63个测定序列中有四对序列几乎完全一致。利用RNA structure4.3软件模拟适体的二级结构,发现序列的二级结构以茎环、发夹、G-四聚体为主,各家族、各序列出现的茎环结构数目不等,且各家族在茎环的大小和位置存在差别。 4.胶体金标记适配子斑点渗滤法检测适配子的特异性,结果显示筛选出的适配子具有较高的特异性。以地高辛—抗地高辛抗体—碱性磷酸酶系统作为桥连测定了不同浓度适配子与靶蛋白的结合力,通过软件分析,适体与PBP2a的解离常数Kd值可低至31.75nM。 [结论] 本研究构建原核表达载体,成功表达出PBP2a转肽酶区蛋白。运用SELEX技术,经过13轮,筛选到针对PBP2a转肽酶区适配子群,建立胶体金标记适配子斑点渗滤法检测适配子的特异性,以地高辛—抗地高辛抗体—碱性磷酸酶系统作为桥连测定了不同浓度适配子与靶蛋白的结合力,证实所筛选到的适配子具有对PBP2a转肽酶区特异性和高亲和力,为后续的检测方法的建立及对MRSA的抑制性实验建立基础。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a 指数富集配基的系统进化技术适配子斑点渗滤法

EGFRvⅢ适配子联合金纳米体内外抑制胶质瘤的作用

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EGFRvⅢ适配子联合金纳米体内外抑制胶质瘤的作用

作者：梁艳玲南方医科大学

学位级别：硕士

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,其中胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）是最常见且恶性程度最高的胶质瘤。因其侵袭性强,生长速度快,病人中位生存期不足两年,目前常规的临床治疗方法都不能很好地治疗GBM,因此探索GBM的靶向... 详细信息

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,其中胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）是最常见且恶性程度最高的胶质瘤。因其侵袭性强,生长速度快,病人中位生存期不足两年,目前常规的临床治疗方法都不能很好地治疗GBM,因此探索GBM的靶向治疗新方法和技术具有重要意义。GBM的发生发展与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的基因突变所引起的异常信号通路密切相关。EGFR的Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）是其中最常见的EGFR突变体,其高表达可增强胶质瘤细胞株的体内外致瘤作用、具有更强的侵袭性、对放化疗产生更强的抵抗性和耐药性等。EGFRvⅢ只存在于恶性肿瘤细胞,不存在于正常组织中,是治疗GBM很好的靶标。目前靶向EGFRvⅢ的药物主要是单克隆抗体,并且还未进入临床使用。抗体类药物具有免疫原性、不易保存、价格高昂、分子量大等缺点。本课题所研究的适配子（Aptamer）容易生产和保存、分子量小、渗透能力强、无免疫原性等特点。另外金纳米（Gold Nanoparticles,GNPS/AuNPs）具有低毒性和高生物相容性,容易被修饰,是理想的生物载体。虽然适配子本身不易通过血脑屏障,但AuNPs与适配子结合后,使得适配子通过血脑屏障并作用于GBM成为可能。在本课题组的前期工作中,通过Cell-SELEX技术以U87-EGFRvⅢ细胞为靶标筛选获得DNA适配子并命名为U2。在此基础上,我们将巯基修饰的U2通过金硫键与AuNPs共价结合形成AuNP-U2复合物,并通过透射电镜和动态光散射仪对AuNP-U2复合物进行表征验证了 U2和AuNPs能稳定连接。然后进一步在细胞水平、分子水平和动物水平上对AuNP-U2体内外抑制GBM的作用进行研究。在细胞水平上,通过EdU法来探究AuNP-U2复合物对U87-EGFRvⅢ细胞增殖能力的影响;通过transwell实验来探讨AuNP-U2复合物对U87-EGFRvⅢ细胞的侵袭能力的影响。在分子水平上,通过Western Blot验证AuNP-U2对U87-EGFRvⅢ细胞的EGFRvⅢ自磷酸化及DNA损伤修复能力的影响。在动物水平上,研究了脑内注射AuNP-U2复合物对GBM模型裸鼠的生存时间的影响和尾静脉注射AuNP-U2复合物以探究AuNP-U2是否能通过GBM模型裸鼠的血脑屏障。研究结果显示适配子U2联合AuNPs形成的AuNP-U2复合物能明显抑制U87-EGFRvⅢ细胞的增殖和侵袭能力,还可以明显抑制EGFRvⅢ蛋白的自磷酸化及DNA损伤修复能力,说明AuNP-U2在体外有明显的抑制GBM的作用。并且脑内注射AuNP-U2复合物可以延长GBM模型裸鼠的生存时间,说明AuNP-U2在体内有明显抑制GBM的作用。AuNP-U2复合物能通过血脑屏障,确保了 U2在体内对GBM发挥抑制作用,为下一步体内治疗打下研究基础。以上结果表明,AuNP-U2复合物对GBM有很好的体内外抑瘤作用,可为GBM的靶向治疗提供新的技术和平台。

关键词：适配子金纳米胶质母细胞瘤 EGFRvⅢ

早期胃腺癌原代细胞适配子的筛选及细胞膜分子标志物的初步提取

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早期胃腺癌原代细胞适配子的筛选及细胞膜分子标志物的初步提取

作者：郭鹏兰州大学

学位级别：硕士

目的：运用胶原酶Ⅳ型溶液分离提取早期胃腺癌原代细胞为靶细胞,利用cell-SELEX技术筛选出靶细胞的核酸适配子,通过对适配子的分析,选择亲和力或特异性高的适配子初步提取靶细胞膜表面的分子标志物,为早期胃腺癌诊断和治疗奠定分子靶点... 详细信息

目的：运用胶原酶Ⅳ型溶液分离提取早期胃腺癌原代细胞为靶细胞,利用cell-SELEX技术筛选出靶细胞的核酸适配子,通过对适配子的分析,选择亲和力或特异性高的适配子初步提取靶细胞膜表面的分子标志物,为早期胃腺癌诊断和治疗奠定分子靶点基础。方法：利用胶原酶Ⅳ型溶液分离提取早期胃腺癌原代细胞和正常胃黏膜细胞,经上皮角蛋白抗体CK8和CK18进行免疫组化分析细胞纯度。应用人工合成的全长为88nt,中间为52nt随机序列,两端各为18nt的单链DNA文库,以早期胃腺癌原代细胞为靶细胞,正常胃粘膜细胞为反筛细胞进行cell-SELEX筛选。经过多轮筛选,将最后一轮的ssDNA次级文库通过PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T载体连接,经转化,蓝白筛选,随机选择30个白色克隆子进行测序。利用DNAMAN7.0软件对适配子进行一级结构同源性分析和二级结构预测,利用荧光素标记引物进行PCR扩增,对各适配子进行亲和力和特异性测定。利用生物素-链霉亲和素磁珠法,选择特异性或亲和力高的适配子,初步提取早期胃腺癌原代细胞膜表面的分子标志物。结果：1.利用0.1%胶原酶Ⅳ型溶液分离得到的早期胃腺癌原代细胞和正常胃粘膜上皮细胞在纯度均在90%以上,可以满足cell-SELEX筛选的要求。2.在进行筛选之前对PCR扩增条件优化,确定了最佳的退火温度为46℃,循环次数为15次。经过12轮筛选后,得到的ssDNA次级文库与早期胃腺癌的结合率达到较高水。经蓝白筛选和测序后,适配子的一级结构中同，C15和C23号适配子的随机序列少一个核苷酸,C29号适配子的序列中间随机序列多一个核苷酸,另外27个适配子的序列长度与预期一致，其中有C17号和C27号的序列完全一致。同源性分析发现,序列无共有保守序列。二级结构预测可知,适配子形成了不同的茎环结构,这种茎环结构是适配子与靶细胞结合的结构基础。3.特异性分析可知,适配子与胃腺癌原代细胞组结合的荧光强度,与正常胃粘膜上皮细胞组、空白对照组之间结合的荧光强度值差异非常显著(P适配子与早期胃腺癌原代细胞的解离系数达到nmol/L,具有很高的亲和力。4.选择一种特异性较强的适配子,借助生物素-链霉亲和素磁珠进行靶物质初步提取,然后进行SDS-PAGE电泳后,可以看到适配子所结合的细胞膜表面分子标志物的分子量在100kDa附近,而且条带相对清晰,运用蛋白酶作用细胞后,适配子与细胞结合的荧光强度前有具有统计学差异(P适配子结合的物质上有蛋白质成份。结论：1.利用胶原酶Ⅳ型溶液能成功分离出原代细胞,而且纯度较高,可以作为一种细胞分离的方法应用于后期研究。2.利用cell-SELEX技术能够针对早期胃腺癌原代细胞筛选出特异性的适配子,并且适配子的结构较完整,二级结构预测中茎环结构可能是适配子与靶细胞结合的结构基础。3.实验采用荧光素修饰适配子的方法能成功的测定适配子与早期胃腺癌细胞结合的特异性和亲和力。在测试的结果中发现,培养状态下的细胞株与从组织中分离获得的细胞在和适配子结合的时候,两者的荧光强度值具有统计学意义。4.采用生物素修饰适配子,结合链霉亲和素磁珠分离系统,能够从早期胃腺癌原代细胞表面分离出特异的分子标志物,得知分子标志物的大致分子量,并可以确定细胞膜分子标志物有蛋白质成份。

关键词：早期胃肿瘤腺癌原代细胞适配子分子标志物

肝脏去唾液酸糖蛋白受体特异性RNA适配子的SELEX筛选与鉴定

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医学分子生物学杂志 2009年第3期6卷 197-202页

作者：刘嘉杨燕胡斌马智勇余源黄红平陆蒙吉冯新华郭培宣杨东亮华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室湖北武汉市430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院实验医学研究中心湖北武汉市430030 华中科技大学同济医学院微生物学教研室湖北武汉市430030 贝勒医学院分子与细胞牛物学系TX77030 美国辛辛那提大学医学院生物医学工程系OH45267 美国

目的获得能够特异性高亲和力结合肝脏特异性去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的RNA适配子，为开发诊断和治疗肝脏疾病的靶向性试剂和药物奠定基础。方法合成一个长度为115nt含有25个随机序列的单链DNA随机文... 详细信息

目的获得能够特异性高亲和力结合肝脏特异性去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的RNA适配子，为开发诊断和治疗肝脏疾病的靶向性试剂和药物奠定基础。方法合成一个长度为115nt含有25个随机序列的单链DNA随机文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库，以肝脏ASGPR大亚基为靶蛋白，采用SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）技术筛选具有高亲和力的AsGPR特异性RNA适配子；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力。结果经过12轮筛选获得了具有高亲和力的肝脏ASGPR特异性RNA适配子。结论成功地筛选出了具有离亲和力的肝脏ASGPR特异性RNA适配子库。

关键词：适配子 SELEX技术去唾液酸糖蛋白受体