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SELEX技术筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌适配子的研究

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中华医院感染学杂志 2013年第13期23卷 3041-3043页

作者：汪江波李赞东赵延斌侯德凤廖玲李艳红毛伟丽广西壮族自治区南溪山医院药剂科广西桂林541002 广西壮族自治区南溪山医院检验科广西桂林541002 广西壮族自治区南溪山医院科教科广西桂林541002 广西壮族自治区南溪山医院医保科广西桂林541002 广州医学院广东广州510182

目的利用指数富集的配体进化技术(SELEX)筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的适配子,并研究适配子AM6与MRSA结合的特异性,为研发MRSA的特异性诊断试剂和靶向治疗药物打下基础。方法体外构建81个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库;通过反复... 详细信息

目的利用指数富集的配体进化技术(SELEX)筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的适配子,并研究适配子AM6与MRSA结合的特异性,为研发MRSA的特异性诊断试剂和靶向治疗药物打下基础。方法体外构建81个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库;通过反复的SELEX筛选获得MRSA的适配子并进行一级结构分析;利用荧光显微镜和PCR扩增法鉴定AM6与MRSA结合的特异性。结果经过20轮环筛选,获得了25个与预期大小相同的ssDNA序列,它们之间没有共同的保守序列;AM6仅与MRSA结合,而不与甲氧西林敏感葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRSCN)、甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(MSSCN)、大肠埃希菌结合。结论利用SELEX技术成功地筛选出MRSA的适配子,其中适配子AM6能特异性结合MRSA。

关键词：指数富集的配体进化技术耐甲氧西林金黄色葡萄球菌适配子

肿瘤细胞特异性适配子筛选技术及其应用的研究进展

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中国肿瘤生物治疗杂志 2011年第5期18卷 561-564页

作者：张瑞秀徐文殷正丰第二军医大学东方肝胆外科医院分子肿瘤实验室上海200438

指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过筛选、分离、富集获得能与各种配体特异结合的寡核苷酸适配子(aptamer)。适配子能特异性结合多肽... 详细信息

指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过筛选、分离、富集获得能与各种配体特异结合的寡核苷酸适配子(aptamer)。适配子能特异性结合多肽、蛋白质等多种靶分子,且具有高亲和力。细胞-SELEX技术在SELEX基础上发展起来,它以活细胞为基础,可以在对肿瘤细胞分子标志物一无所知的情况下有效地筛选出肿瘤细胞特异性适配子,是一个潜在的发现肿瘤细胞新标志物的理想策略。肿瘤细胞特异性适配子作为分子探针,在肿瘤基础研究、早期诊断,以及靶向治疗方面展示了巨大的应用前景。目前已筛选出淋巴细胞白血病、肝癌等多种肿瘤细胞的适配子,这些适配子已应用在肿瘤细胞检测,肿瘤早期发现、诊断、游离肿瘤细胞的分选和富集,以及肿瘤细胞靶向药物递送等方面,并且由于适配子适用范围广泛、易于修饰等特点,显示出良好的敏感性、特异性和其他独特的优越性。适配子在肿瘤研究中受到越来越多的关注,在肿瘤检测、诊断和治疗等方面发挥重要作用。

关键词：细胞-SELEX 适配子肿瘤细胞

SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立

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生物技术 2009年第3期19卷 42-46页

作者：李真真韩跃武刘玲玲韩亚萍路艳王春霞兰州大学基础医学院医学生物化学与分子生物学研究所甘肃兰州730000

目的:建立SELEX技术筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,并初步鉴定获得的SGC-7901细胞适配子。方法:体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库,通过优化PCR扩增条件,利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SELEX反... 详细信息

目的:建立SELEX技术筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,并初步鉴定获得的SGC-7901细胞适配子。方法:体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库,通过优化PCR扩增条件,利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SELEX反复筛选获得胃癌SGC-7901细胞的特异性适配子。将最后一轮筛选产物克隆、测序并用相关软件分析适配子序列的一级结构和二级结构。结果:经12轮SELEX筛选,ssDNA文库与SGC-7901细胞的亲和力由0.16上升至1.14,表明特异性适配子得到逐步富集。22个克隆子测序,有4个序列完全一致,二级结构预测茎环可能是适配子与胃癌细胞作用的结构基础。结论:成功建立了SELEX技术体外筛选胃癌细胞SGC-7901高亲和性适配子的方法。

关键词：胃癌细胞 SELEX 适配子随机ssDNA文库

DNA聚合酶适配子6-10提高定量PCR的特异性

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临床检验杂志 2009年第3期27卷 164-166页

作者：刘峰涛柴立辉马远方河南大学医学院河南省天然药物与免疫工程重点实验室河南开封475004

目的利用DNA聚合酶适配子6-10进行热启动定量PCR,提高定量PCR的检测灵敏度。方法适配子6-10组、抗体对照组和非热启动对照组分别进行定量PCR,制作标准曲线,以复相关系数(r2)大于0.99为线性范围,比较其线性范围下限。结果非热启动定量PC... 详细信息

目的利用DNA聚合酶适配子6-10进行热启动定量PCR,提高定量PCR的检测灵敏度。方法适配子6-10组、抗体对照组和非热启动对照组分别进行定量PCR,制作标准曲线,以复相关系数(r2)大于0.99为线性范围,比较其线性范围下限。结果非热启动定量PCR对人死亡受体5(death receptor 5,DR5)的检测线性范围下限为105拷贝/μl,而适配子6-10(200nmol/L)与抗DNA聚合酶抗体方法对DR5的检测线性范围下限为103拷贝/μl。熔解曲线分析表明,在扩增高浓度靶分子(105拷贝/μl)时,各种方法非特异扩增均不明显,没有形成非特异峰;在扩增低浓度靶分子(103拷贝/μl)时,非热启动对照组的非特异扩增明显,产生明显的非特异峰,而DNA聚合酶适配子6-10可以明显消除非特异扩增形成的非特异峰。结论DNA聚合酶适配子6-10可以提高定量PCR的检测灵敏度。

关键词：适配子 DNA聚合酶热启动PCR 定量PCR

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早期胃腺癌原代细胞适配子的筛选与鉴定

中国生物化学与分子生物学报 2013年第3期29卷 250-256页

作者：郭鹏习静张雪燕姚海燕马驰马鑫杨敏冯慧婷侯纯荣徐先云韩跃武兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所兰州730000

胃腺癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,由于没有针对早期胃腺癌有效的诊断方法,目前胃腺癌手术治疗还主要针对中晚期患者,预后差.本文应用cell-SELEX技术,筛选早期胃腺癌原代细胞的适配子,为早期胃腺癌的诊断提供新的思路.从早期胃腺癌... 详细信息

胃腺癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,由于没有针对早期胃腺癌有效的诊断方法,目前胃腺癌手术治疗还主要针对中晚期患者,预后差.本文应用cell-SELEX技术,筛选早期胃腺癌原代细胞的适配子,为早期胃腺癌的诊断提供新的思路.从早期胃腺癌组织中分离得到早期胃腺癌原代细胞,应用体外合成全长88 bp中间含52 bp随机序列的单链DNA文库,通过对PCR扩增条件的优化,借助生物素-链霉亲和素磁珠系统,经cell-SELEX反复筛选,可获得针对早期胃腺癌原代细胞的特异性适配子.经12轮cell-SELEX筛选,ssDNA文库与早期胃腺癌原代细胞的亲和力由1 560上升到4 336,表明亲和力较高的适配子得到逐步富集.经克隆和测序,应用软件分析可知,30个克隆子中编号为C17和C27的2个序列完全一致,具同源性,二级结构预测可知单链DNA形成不同的茎环结构可能是适配子与早期胃腺癌原代细胞作用的结构基础.特异性分析显示,胃腺癌原代细胞组与正常胃粘膜上皮细胞、空白对照组之间荧光强度值差异非常显著(P0.05).经亲和力测定,各适配子与早期胃腺癌原代细胞的解离系数达到nmol/L,具有很高的亲和力.利用cell-SELEX技术成功筛选到早期胃腺癌原代细胞的适配子,为胃腺癌的早期诊断与治疗药物靶点方面的研究奠定了实验基础.

关键词：胃肿瘤腺癌细胞-SELEX 适配子随机单链DNA文库

基于ssDNA适配子的慢性粒细胞白血病K562细胞检测方法的建立

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中国生物制品学杂志 2011年第7期24卷 845-848页

作者：查成喜韩跃武张雪燕杨浩夏艳郭鹏兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所兰州730000

目的建立基于ssDNA适配子的慢性粒细胞性白血病K562细胞的检测方法。方法利用Cell-SELEX(Sys-tematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术获得针对K562细胞的高特异性ssDNA适配子,以双位点结合模式试验原理,结合生物... 详细信息

目的建立基于ssDNA适配子的慢性粒细胞性白血病K562细胞的检测方法。方法利用Cell-SELEX(Sys-tematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术获得针对K562细胞的高特异性ssDNA适配子,以双位点结合模式试验原理,结合生物素链霉亲和素磁珠技术,建立K562细胞的特异性检测方法,并验证其特异性及灵敏度。结果利用建立的方法分别检测K562细胞、HL-60细胞及空白对照细胞,K562组与HL-60组和空白对照组荧光强度值差异有统计学意义(P0.05),表明该方法特异性强;该方法能检测出数量小于100个的K562细胞,检测阈值低,灵敏度高。结论已成功建立了基于ssDNA适配子的检测K562细胞的新方法,为慢性粒细胞性白血病的分子诊断提供了一种新方法,也为分离K562细胞表面物质提供了新的思路。

关键词： K562细胞适配子双位点结合试验生物素-链霉亲和素磁珠分子诊断技术

快速检测TOX、CMVIgG抗体的适配子型SPR传感器微阵列的初步构建

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第三军医大学学报 2012年第8期34卷 765-767页

作者：刘星秦莲花罗阳苗杰王丰黄庆黄君富胡忠义府伟灵第三军医大学西南医院检验科重庆400038 同济大学附属上海市肺科医院、上海市结核病肺重点实验室上海200433

目的初步构建弓形虫(toxoplasma gondii,TOX)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)IgG抗体的适配子型SPR传感器微阵列的快速检测方法。方法采用SELEX技术筛选TOX、CMV IgG的适配子,并将其整合于SPR生物传感器实时在线分析系统,通过在传感... 详细信息

目的初步构建弓形虫(toxoplasma gondii,TOX)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)IgG抗体的适配子型SPR传感器微阵列的快速检测方法。方法采用SELEX技术筛选TOX、CMV IgG的适配子,并将其整合于SPR生物传感器实时在线分析系统,通过在传感器表面固定探针分子,对溶液中的TOX、CMV IgG进行杂交检测,并进一步研究该检测方法的稳定性与线性检范围。结果该新型快速检测方法能够实现对TOX、CMV IgG的实时检测,检测系统稳定性良好,八通道间检测时互不影响,线性检测范围为20～300μmol/L。结论该实验建立的快速检测方法,具有稳定性好等优点,SPR传感器技术结合适配子技术在临床诊断工作中有着广阔的应用前景。

关键词：生物芯片适配子 SPR传感器

应用CS-SELEX技术筛选特异性结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B适配子的研究

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中国病原生物学杂志 2015年第2期10卷 97-101页

作者：曾德钰潘勤章晓联武汉大学基础医学院免疫学系病毒学国家重点实验室湖北省过敏及免疫相关疾病重点实验室湖北武汉430071

目的应用CS-SELEX(cell surface-system evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白4B(non protein 4B,NS4B)特异性结合的ssDNA适配子,建立检测HCV NS4B的酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法。方法构建pDisplay-NS4B质粒,并转染至HepG2细胞中,在G418存在情况下连续筛选1个月,得到单克隆细胞群,经过Western blot以及流式细胞术验证,获得稳定表达NS4B的HepG2细胞。设计并合成随机序列ssDNA文库,以稳定表达NS4B的细胞为正向筛选靶细胞,以HepG2细胞为反筛细胞进行CS-SELEX技术筛选。每轮筛选获得的具有结合NS4B能力的ssDNA适配子,通过PCR扩增得到富集,随后通过不对称PCR获得下一轮筛选的ssDNA文库。经过16轮筛选,将亲和力最高的筛选产物克隆并测序,用ELONA方法检测适配子的亲和力。结果成功构建表面展示表达重组质粒pDisplay-NS4B。分别将该质粒转入HepG2细胞,通过G418筛选获得稳定表达HCV-NS4B的细胞系NS4B-HepG2。对CS-SELEX筛选的各轮适配子库进行亲和力测定,其中第14轮库适配子与NS4B的亲合力最高。分别对第14轮库中的单个适配子进行亲和力测定,以适配子ZN1和ZN5与NS4B的亲合力最高。ZN1和ZN5不仅能结合展示在细胞表面的NS4B蛋白,还能结合丙型肝炎病毒感染细胞(HCV cell culture,HCVcc)中的HCV-NS4B蛋白。结论适配子ZN1和ZN5对NS4B有高亲和力,这对研究HCV-NS4B致癌机制、HCV诊断以及治疗方面有潜在的应用价值。

关键词：丙型肝炎病毒(HCV) 非结构蛋白-NS4B CS-SELEX 适配子

cell-SELEX筛选的适配子在肿瘤诊断和治疗中的应用

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生物技术 2012年第5期22卷 93-96页

作者：吴红艳汪付兵三峡大学医学院免疫系湖北宜昌443002 武汉大学中南医院检验科湖北武汉430071

抗肿瘤治疗发展迅速,但仍然存在许多问题,例如早期诊断困难及化疗的副反应。为解决这些问题,适配子、包括单链DNA或RNA寡核苷酸受到越来越多的关注。适配子具有高度选择性、亲和力及稳定性。通过指数富集细胞配体系统进化技术(cell-SEL... 详细信息

抗肿瘤治疗发展迅速,但仍然存在许多问题,例如早期诊断困难及化疗的副反应。为解决这些问题,适配子、包括单链DNA或RNA寡核苷酸受到越来越多的关注。适配子具有高度选择性、亲和力及稳定性。通过指数富集细胞配体系统进化技术(cell-SELEX)筛选到的寡核苷酸在识别病变细胞方面具有很大优势,因此,它具有应用于诊断和治疗的巨大潜力。该文综述了适配子在生物标记物的发现、肿瘤细胞富集和检测、靶向肿瘤治疗中的作用。

关键词： cell-SELEX 适配子靶向肿瘤治疗