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人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子筛选及结构分析

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中国免疫学杂志 2015年第1期31卷 82-85页

作者：平娟赵娜申智慧阴明星张倩张伟马雪姗陈传波河南大学淮河临床学院开封475001 河南省肿瘤医院郑州450009 中国科学院生物物理研究所北京100101

目的:筛选、鉴定人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子。方法:利用SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术,以高纯度融合蛋白BCR-ABL为靶分子,从体外化学合成的长度为90 bp的随机单链DNA文库中来筛选与融合蛋白... 详细信息

目的:筛选、鉴定人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子。方法:利用SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术,以高纯度融合蛋白BCR-ABL为靶分子,从体外化学合成的长度为90 bp的随机单链DNA文库中来筛选与融合蛋白BCR-ABL特异性结合的寡核苷酸适配子,并进行解离常数(Kd)值测定和适配子序列测定,再分别用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子一级结构及二级结构,以酶联仪测定OD450值,根据OD值高低判定适配子亲和力大小。结果:经过13轮筛选,随机ss DNA文库与融合蛋白的亲和率从0.3%上升到47.1%,所有的一级结构没有共同的同源序列,二级结构分析结果显示,茎和环等二级结构可能是适配子和融合蛋白BCR-ABL结合的基础,其中,寡核苷酸适配子A2与BCR-ABL亲和力最高,kd值达72 nmol/L。结论:利用随机寡核苷酸文库筛选技术成功获得抗融合蛋白适配子,为临床上治疗和预防慢性粒细胞白血病提供一定的参考。

关键词： SELEX技术慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL 适配子筛选

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病理类型特异的卵巢癌组织适配子的鉴定

军事医学 2013年第1期37卷 58-61页

作者：王玮丁红梅李慧李洁夏伟邵宁生李少华军事医学科学院基础医学研究所

目的鉴定经组织切片消减SELEX筛选获得的4条候选适配子对不同类型卵巢癌组织的识别特性。方法公司合成、荧光素修饰候选适配子,利用免疫荧光实验对筛选获得的适配子候选序列进行鉴定。结果免疫荧光实验证明,适配子OC-10-19和OC-10-36能... 详细信息

目的鉴定经组织切片消减SELEX筛选获得的4条候选适配子对不同类型卵巢癌组织的识别特性。方法公司合成、荧光素修饰候选适配子,利用免疫荧光实验对筛选获得的适配子候选序列进行鉴定。结果免疫荧光实验证明,适配子OC-10-19和OC-10-36能够特异识别卵巢浆液性乳头状囊腺癌,且OC-10-36还能够对早期的不典型增生进行识别,另2条适配子OC-10-10和OC-10-37仅识别个别的卵巢浆液性囊腺癌。结论成功筛选获得识别不同类型卵巢癌组织的特异适配子,为适配子用于不同病理类型标志物的鉴定、临床辅助诊断等提供了理论基础。

关键词：卵巢肿瘤适配子 SELEX适体技术病理类型

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鼻咽癌核酸适配子的筛选及鉴定

重庆医学 2013年第19期42卷 2198-2200,2203页

作者：陈文学张焜和邹学森陈岳青李金高南昌大学第一附属医院消化研究所南昌330000 江西省肿瘤医院检验科南昌330000

目的利用指数富集的配套系统进化技术(SELEX)筛选人类疱疹病毒(EB病毒)阳性鼻咽癌细胞核酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA文库,通过SELEX技术,以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选,以EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶... 详细信息

目的利用指数富集的配套系统进化技术(SELEX)筛选人类疱疹病毒(EB病毒)阳性鼻咽癌细胞核酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA文库,通过SELEX技术,以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选,以EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶标进行10轮的筛选,克隆、测序,并对适配子进行鉴定。结果流式细胞仪检测亚文库与靶细胞的结合能力随着筛选轮数的增加荧光强度增强。聚类分析显示,适配子可以分为3个家族,1、2家族具有保守序列。结论初步建立EB病毒阳性鼻咽癌细胞适配子库,筛选到具有亲和力和特异性的核酸适配子。

关键词：鼻咽肿瘤适配子指数富集的配套系统进化技术

HCMV PP65抗原核酸适配子的筛选及活性鉴定

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第三军医大学学报 2014年第10期36卷 1040-1044页

作者：夏宇王永虎秦莲花韩梅姚远和昱辰罗娟张波第三军医大学西南医院全军检验医学中心重庆400038 同济大学附属上海市肺科医院、上海市结核病肺重点实验室上海200433

目的以人巨细胞病毒HCMV PP65抗原为靶分子,筛选与其有高亲和力、高特异性的适配子。方法采用SELEX技术筛选HCMV PP65抗原特异的适配子,进行亲和性检测以及二级结构预测,以筛选获得的最优序列作为捕获适配子,建立基于"磁珠-适配子-抗原... 详细信息

目的以人巨细胞病毒HCMV PP65抗原为靶分子,筛选与其有高亲和力、高特异性的适配子。方法采用SELEX技术筛选HCMV PP65抗原特异的适配子,进行亲和性检测以及二级结构预测,以筛选获得的最优序列作为捕获适配子,建立基于"磁珠-适配子-抗原-荧光单克隆抗体"的夹心检测方法,实现对PP65抗原的初步检测。结果本实验经过8轮筛选获得6条与靶物质高亲和性,高特异性结合的适配子。结论适配子的成功筛选,为建立基于适配子检测HCMV PP65抗原的新方法奠定了基础。

关键词：人巨细胞病毒 PP65 抗原 SELEX 适配子

适配子U2的胶质瘤放射敏感性及其联合金纳米的体外抑瘤作用的初步研究

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适配子U2的胶质瘤放射敏感性及其联合金纳米的体外抑瘤作用的初步...

作者：彭立南方医科大学

学位级别：硕士

胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是脑肿瘤中恶性程度高、预后较差的恶性肿瘤,其中位生存期平均仅有14.6个月,目前的治疗手段主要是手术切除合并术前、术后的放化疗,以提高病人的生存期。由于胶质母细胞瘤的侵袭性强,边界不清,手术切除... 详细信息

胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是脑肿瘤中恶性程度高、预后较差的恶性肿瘤,其中位生存期平均仅有14.6个月,目前的治疗手段主要是手术切除合并术前、术后的放化疗,以提高病人的生存期。由于胶质母细胞瘤的侵袭性强,边界不清,手术切除后复发率较高,加上放疗抵抗与化疗抵抗的现象使得胶质母细胞瘤的治疗越发困难,寻求有效的靶向治疗成为了胶质瘤研究领域的新思路。胶质母细胞瘤中常见表皮生长因子受体的扩增和突变。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)及其第三种突变体 EGFRvⅢ的扩增与过表达可加剧胶质母细胞瘤的致瘤性。EGFRvⅢ不需要通过与配体表皮生长因子结合即可形成二聚体持续自磷酸化,激活下游信号通路完成信号转到从而促进胶质母细胞瘤的增殖与侵袭。适配子是通过SELEX技术筛选而来的单链寡核苷酸,因与其靶标具有高亲和力、高特异性越来越受到研究者的重视。金纳米颗粒因具备良好的光电性能已逐渐在纳米递药系统中广泛研究。本课题的主要目的是探究适配子U2对胶质母细胞瘤的放射增敏作用机制及将其联合金纳米颗粒后对胶质母细胞瘤体外的抑瘤作用的初步研究。在本课题研究中,我们首先通过流式细胞术验证了本课题组前期通过Cell-SELEX技术筛选得到的适配子U2对过表达EGFRvⅢ的U87MG细胞即U87-EGFRvⅢ细胞的特异性,利用细胞免疫染色的方法探究适配子U2进入U87-EGFRvⅢ细胞的机制,并通过蛋白免疫印迹的方法研究适配子对U87-EGFRvⅢ细胞产生抑制增殖、迁移和侵袭作用的分子机制;然后通过联合X-射线研究适配子U2能否起到放射增敏的作用,利用克隆形成实验与彗星实验对U2放射增敏效果进行检测,利用蛋白免疫印迹的方法探究放射增敏的分子机制;最后将适配子U2与粒径为15nm的金纳米球形颗粒连接后通过紫外-可见分光光度计、透射电镜、动态光散射仪和琼脂糖凝胶电泳检测是否将适配子U2与金纳米颗粒成功连接,然后检测其体外抑瘤的初步作用。通过将多种胶质瘤细胞系与FAM标记的适配子进行孵育后通过流式细胞仪进行计数,发现FAM-U2与FAM-Scr1的结合率均低于5%,而FAM-U2与U87-EGFRvⅢ细胞结合率高达95%;通过激光共聚焦荧光显微镜可检测到U2可进入U87-EGFRvⅢ细胞内,并发现U2-EGFRvⅢ-初级内体三者在胞内发生共标;通过Western Blot检测可知U2处理U87-EGFRvⅢ细胞6h后可显著降低EGFRvⅢ蛋白的磷酸化水平而不改变其总蛋白的水平,与此同时并未检测到PDGFR β的高表达;U2处理后可检测到EGFRvⅢ蛋白下游的MET和ERK蛋白的磷酸化水平也发生显著降低。在放射敏感性研究中表明,U2联合X射线处理后可明显降低U87-EGFRvⅢ细胞的克隆形成率,增加DNA片段的产生,在彗星实验中表现为彗尾拖长,尾部DNA含量、尾矩和Olive矩增加;通过Western Blot技术检测U2联合X射线处理后可抑制DNA损伤修复信号分子pH2A.X,ATM,Chk2的磷酸化水平及53BP1的总蛋白水平;与此同时EGFRvⅢ蛋白水平其磷酸化水平在U2联合X射线放射处理后亦发生显著性降低。在适配子U2联合金纳米的研究中可观察到,通过适配子修饰后可提高金纳米颗粒在盐溶液中的稳定性;通过透射电镜、动态光散射仪、紫外-可见分光光度计和水平琼脂糖凝胶电泳等方法验证后可知金纳米颗粒成功与适配子连接,金纳米颗粒的最大吸收峰发生红移。通过EdU染色法检测U87-EGFRvⅢ细胞的增殖能力可知,适配子U2-金纳米复合物能对靶细胞的增殖能力发挥显著地抑制作用。结果表明:适配子U2是通过抑制EGFRvⅢ蛋白的磷酸化水平进而抑制其下游信号通路从而影响U87-EGFRvⅢ细胞的增殖迁移侵袭和凋亡;适配子U2联合X-射线可作为放疗增敏剂应用于临床;金纳米-适配子复合物的制备可高效抑制U87-EGFRvⅢ细胞的生长,利于其在体内穿透血脑屏障更好地发挥抑瘤作用。

关键词：适配子恶性胶质瘤金纳米放疗增敏 EGFRvⅢ

全细菌SELEX技术筛选鸟分枝杆菌的适配子

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中国病原生物学杂志 2015年第2期10卷 113-117,179页

作者：王培培刘焰罗凤玲章晓联武汉大学基础医学院免疫学系病毒学国家重点实验室湖北省过敏及免疫相关疾病重点实验室湖北武汉430071

目的应用指数级富集配体系统进化技术(system evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选与鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)特异性结合的ssDNA适配子,建立酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)检测鸟分枝杆菌的方法。方法设计并合成随机序列ssDNA文库,以鸟分枝杆菌为靶标,利用SELEX技术筛选特异性的ssDNA适配子,将亲和力最高的适配子进行克隆、测序;用DNAMAN软件分析适配子的二级结构,并检测其特异性。结果单适配子N1与鸟分枝杆菌结合的Kd为(246±21.87)nmol/L,即亲和力最高,而对结核分枝杆菌等其他分枝杆菌亲和力较低。结论应用SELEX筛选的鸟分枝杆菌ssDNA适配子N1具有较高亲和力和特异性,可作为鸟分枝杆菌检测及艾滋病合并鸟分枝杆菌感染的特异性诊断制剂。

关键词：鸟分枝杆菌 SELEX 适配子

适配子修饰PLGA纳米粒子靶向基因载体的构建及初步应用

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适配子修饰PLGA纳米粒子靶向基因载体的构建及初步应用

作者：邹琼中山大学

学位级别：硕士

研究背景及目的在全世界范围内，前列腺癌是男性第二位的恶性肿瘤，居男性肿瘤死亡病因的第六位。近半数前列腺癌在诊断时已进入晚期，或转化为抗拒激素治疗的前列腺癌，传统治疗方法如手术、放疗、内分泌治疗和化疗等疗效欠佳，仍... 详细信息

研究背景及目的在全世界范围内，前列腺癌是男性第二位的恶性肿瘤，居男性肿瘤死亡病因的第六位。近半数前列腺癌在诊断时已进入晚期，或转化为抗拒激素治疗的前列腺癌，传统治疗方法如手术、放疗、内分泌治疗和化疗等疗效欠佳，仍需要寻求安全有效的治疗措施。基因治疗是有效且序列特异性的治疗手段，可能有助于晚期前列腺癌的治疗，其中反基因技术通过三螺旋形成寡核苷酸（TFO）在靶基因局部形成DNA三螺旋从而在转录水平抑制基因的表达和细胞增殖。基因治疗的关键是选择高效的基因载体。高分子聚合物纳米粒子（NP）性能优良作为基因载体被广泛研究，但缺乏主动靶向性。适配子（Apt）因其高度特异性和亲和力，逐渐成为肿瘤靶向治疗的热点。本课题使用生物相容性好、生物可降解的聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）及靶向前列腺特异性膜抗原的A10适配子，制备包裹TFO的靶向纳米药物TFO-NP-Apt，检测其纳米表征和药理学特性并初步探讨其体外抑制前列腺癌细胞增殖的作用，为前列腺癌提供新的治疗药物。材料和方法 1、药物制备：通过酸胺缩合反应将PLGA-COOH与NH2-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-COOH，NH2-A10适配子与PLGA-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-Apt，核磁共振氢谱验证两步连接。采用双乳化溶剂挥发法制备包裹TFO的纳米药物TFO-NP-Apt。动态激光光散射法测定纳米粒子的平均粒径和分散系数，相位分析光散射技术测定表面zeta电位。扫描电子显微镜下观察纳米粒子的表面形态。核酸/蛋白分析仪间接测定TFO含量计算纳米药物对TFO的包封率和载药量，体外药物释放实验验证纳米药物的缓释性。 2、细胞实验：制备荧光标记的TFO-NP-Apt、TFO-NP和TFO，分别在与细胞共培养后30min、1h、2h在荧光显微镜下定性评价前列腺癌LNCaP细胞（PSMA+、AR+）的摄取情况，流式细胞术定量评价细胞摄取情况。CCK-8试验设立TFO-NP-Apt、TFO-NP、TFO和NP组，24h、48h和72h组检测药物抗LNCaP增殖的量效关系和时效关系。细胞实验选用前列腺癌PC3细胞（PSMA-、AR-）作为对照组。结果 1、核磁共振氢谱分别在3.3-3.9ppm和1.2-1.7ppm出现PEG和Apt的特征峰，验证了PLGA-PEG-Apt的合成;动态激光散射法结果显示制备的纳米粒子平均粒径为225.2±8.1nm（Mean±SD，n=3），分散系数为0.096±0.02，粒径分布较集中，zeta电位约-35.5±3.3mV;扫描电镜下观察纳米粒子呈圆形，表面光滑，粒径分布较均匀;包封率为25.4%±3.1%（n=3），载药量为1.34±0.16μg/mg;TFO-NP-Apt的释放呈现突释之后的持续缓释过程。 2、细胞摄取实验中，每个时间段（30min、1h、2h）LNCaP对TFO-NP-Apt的摄取都明显好于TFO-NP和TFO，LNCaP对TFO-NP-Apt的摄取明显好于PC3。流式细胞术定量地验证，随着时间的延长，LNCaP对TFO-NP-Apt的摄取逐渐增多（p均＜0.001）。CCK-8试验表明，TFO-NP-Apt能较好地抑制LNCaP的增殖，这一效果优于TFO-NP和TFO（p＜0.001）;并且随着时间的延长或剂量的增加，TFO-NP-Apt抗LNCaP增殖的作用逐渐增强（p=0.004、p＜0.001）。NP不表现抑制细胞增殖的作用。各时间段，TFO-NP-Apt、TFO-NP、TFO抗LNCaP增殖的作用都强于抗PC3的增殖（p＜0.05）。结论 1、本课题成功制备了A10适配子修饰的PLGA纳米基因药物TFO-NP-Apt。纳米粒子表征理想;载体对基因治疗药物TFO的包封率、载药量理想;药物缓释性较好。 2、在细胞水平验证了纳米药物抗前列腺癌细胞增殖的作用。TFO-NP-Apt提高了LNCaP细胞的药物摄取率，增强了抑制LNCaP细胞增殖的作用，并且其抗增殖作用呈现良好的时效关系和量效关系。

关键词：前列腺癌纳米粒子适配子反基因三螺旋形成寡核苷酸

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适配子靶向治疗药物的研究进展

医学研究生学报 2018年第6期31卷 644-648页

作者：梁志满彭立陈悦张兴梅南方医科大学基础医学院神经生物学教研室广州医学硕士研究生510515

适配子(aptamer)是通过体外指数级富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选得到的能折叠成三维空间结构的单链DNA/RNA寡核苷酸。适配子可特异性识别细胞表面的分子标记,与单克隆抗体相比,具有相似甚至优于抗体的特征,如高特异性、高亲和力、... 详细信息

适配子(aptamer)是通过体外指数级富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选得到的能折叠成三维空间结构的单链DNA/RNA寡核苷酸。适配子可特异性识别细胞表面的分子标记,与单克隆抗体相比,具有相似甚至优于抗体的特征,如高特异性、高亲和力、易于修饰、化学性质稳定、无毒性及低免疫原性等。基于适配子的这些优势,除了自身用作治疗剂,也能特异性地运载药物、纳米粒子、核酸治疗剂到靶细胞内,成为一种能靶向递送治疗药物到细胞、低毒高效的新型工具。文章论述近几年适配子用于靶向治疗的最新进展,为肿瘤等疾病的治疗提供新思路。

关键词：适配子靶向治疗纳米粒子 siRNA

应用SELEX技术筛选沙门氏菌抗原的适配子

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食品科学 2011年第13期32卷 194-197页

作者：郎春燕江树勋邵碧英陈文炳傅碧忠缪婷玉陈融斌黄晓蓉福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室福建福州350001 福建农林大学食品科学学院福建福州350002 集美大学水产学院福建厦门361021

目的:应用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选沙门氏菌抗原的高亲和性适配子。方法:首先合成一个全长78个核苷酸中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库,再以环氧乙烷丙烯酸珠子作为筛选介质,利用生物素-抗地高辛碱性... 详细信息

目的:应用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选沙门氏菌抗原的高亲和性适配子。方法:首先合成一个全长78个核苷酸中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库,再以环氧乙烷丙烯酸珠子作为筛选介质,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与沙门氏菌抗原的亲和力,以获得沙门氏菌抗原的高亲和性适配子。结果:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与沙门氏菌抗原结合后显色,吸光度逐渐增加,初步获得了沙门氏菌抗原的高亲和性适配子。结论:实验所用的筛选流程是适当的,可以考虑推广用于类似靶目标的筛选。

关键词：指数富集配体系统进化技术沙门氏菌抗原适配子