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过表达CXCR4促进小鼠骨髓间充质干细胞的归巢和增殖

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细胞与分子免疫学杂志 2019年第5期35卷 393-398页

作者：王志红林芸叶海燕陈为民尚晋魏天南福建医科大学省立临床医学院福建省立医院血液科

目的研究过表达CXC趋化因子受体4(CXCR4)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体内外归巢特性和细胞增殖活性的影响。方法利用慢病毒载体介导小鼠BMMSC过表达CXCR4,构建过表达CXCR4的细胞(CXCR4-BMMSC)。TranswellTM小室实验检测基质细胞衍生... 详细信息

目的研究过表达CXC趋化因子受体4(CXCR4)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体内外归巢特性和细胞增殖活性的影响。方法利用慢病毒载体介导小鼠BMMSC过表达CXCR4,构建过表达CXCR4的细胞(CXCR4-BMMSC)。TranswellTM小室实验检测基质细胞衍生因子1(SDF-1)对BMMSC迁移能力的影响;噻唑蓝(MTT)法检测BMMSC的增殖能力。BALB/c小鼠接受全身照射(TBI)后,随机分为2组,每组10只。BMMSC对照组:小鼠经TBI后,输注5×10^5个绿色荧光蛋白标记的BMMSC(GFP-BMMSC);CXCR4-BMMSC组:小鼠经TBI后,回输5×10^5个携带GFP的CXCR4-BMMSC。尾静脉回输细胞后,取小鼠胸腺进行冰冻切片,荧光显微镜下观察回输的细胞归巢至胸腺组织的情况;流式细胞术检测BMMSC归巢至受鼠体内胸腺的效率。结果 TranswellTM小室实验证实CXCR4可促进SDF诱导的BMMSC的跨膜迁移;与BMMSC对照组相比,CXCR4-BMMSC的增殖活性显著升高。与BMMSC对照组相比,过表达CXCR4可明显提高BMMSC归巢至胸腺组织的效率;流式细胞术检测结果提示BMMSC归巢至胸腺数量高于对照组。结论过表达CXCR4可增强SDF-1对BMMSC的迁移募集,体内可促进BMMSC归巢至损伤胸腺。CXCR4还可促进小鼠BMMSC的增殖。

关键词： CXC趋化因子受体4(CXCR4) 基质细胞衍生因子1(SDF-1) 骨髓间充质干细胞(BMMSC) 过表达基因移植归巢

苦参总碱、叶绿酸铜钠和三苯氧胺对HT29细胞环氧化酶功能的影响

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苦参总碱、叶绿酸铜钠和三苯氧胺对HT29细胞环氧化酶功能的影响

作者：杨毅浙江大学

学位级别：硕士

研究背景：环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)，又名前列腺素内氧化还原酶，是花生四烯酸代谢过程中的限速酶。COX存在两种亚型，即结构型的COX1和诱生型的COX2。COX1存在于绝大多数组织中，在生理状态下促进前列腺素生成，维护人体正常功... 详细信息

研究背景：环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)，又名前列腺素内氧化还原酶，是花生四烯酸代谢过程中的限速酶。COX存在两种亚型，即结构型的COX1和诱生型的COX2。COX1存在于绝大多数组织中，在生理状态下促进前列腺素生成，维护人体正常功能，如保持胃肠道粘膜的完整性、血管内平衡、激素应答等。COX2则在病理状态下可大量诱导产生，如在巨噬细胞、单核细胞等中可被诱导表达增加20倍以上，在某些癌前病变及肿瘤组织中亦大量表达，同时，有大量证据表明它与肿瘤发生之间存在联系。转基因动物实验发现，转导COX2过表达基因的小鼠大大增加了肿瘤的发生率;相反，COX2基因敲除的小鼠，其肿瘤的发生率则会降低。因此认为COX2与肿瘤发生之间存在“因”与“果”的关系。此外，有研究发现，敲除COX1基因同样可减少肿瘤的发生率，因而认为花生四烯酸代谢在肿瘤发生过程中有着重要的作用。形态学的研究也证实，COX2为抗肿瘤治疗的靶点，应用选择性COX2抑制剂，可减少肠癌、舌癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌及膀胱癌等在实验动物中的发生;对于已存在的肿瘤，则可抑制其生长和转移。流行病学的调查研究显示，长期服用非甾体类抗炎药(NSAIDs)可减少结直肠癌的发生率。新近的研究还发现，COX2可增加肿瘤细胞多样耐药基因(MDR1)的表达及活性，应用选择性COX2抑制剂可克服由于COX2过表达而引起的化疗耐药或放疗敏感性降低等疗效下降的问题。鉴于COX与肿瘤发生、发展的联系，其抑制剂，尤其是选择性COX2抑制剂，作为一种具有巨大潜在价值的肿瘤预防及治疗药物已引起了人们的重视。临床流行病学调查研究和动物实验均证实，COX抑制剂，特别是选择性COX2抑制剂可防治多种类型的肿瘤，且相关的Ⅱ期浙江大学硕士学位论文临床研究也已开展。传统的Cox抑制剂如NSAIDS，由于在抑制CoxZ的同时也抑制了COxl的生理功能，长期使用时往往有较大的副作用，因此特异性干预CoxZ一般可取得较好的效果而不产生大的副作用，筛选选择性COXZ抑制剂对于肿瘤的临床防治有着重大意义。中药制剂苦参总碱(Matrine，MAT)，叶绿酸铜钠(Sodium Copper Chlorophyllin，CHL)和内分泌治疗药物三苯氧胺(Tamoxifen，TAM)，为三种均已在临床中应用，而且被认为是在长期使用时副作用相对较小的药物。因此，本次研究中，我们选择这三种药物作为我们选择性COxZ抑制剂初步筛选的目标。MAT和CHL为两种目前已用于肿瘤辅助治疗的中药制剂。已有研究证实，MAT存在一定的抑瘤作用，可显著抑制白血病细胞K562等肿瘤细胞的增殖并诱导其分化;CHL也被认为存在抗突变、抗肿瘤作用。TAM广泛用于乳腺癌治疗，Brodie等发现，雌激素依赖乳腺癌患者肿瘤中存在芳香化酶和COxZ的高表达。COXZ的产物前列腺素E2 (prostaglandingEZ，PGE2)对肿瘤及其周围组织中的雌激素合成有着强烈的刺激作用，应用COXZ抑制剂可减少雌激素的产生。可见，MAT和TAM均己在临床上用于抗肿瘤治疗，而CHL也已在临床中应用且有实验室证据证明其具有抗肿瘤作用，但这三种药物与COXZ相关性的研究，目前均无报道，故本实验通过研究低浓度下这三种药物对Cox功能的影响，以期为筛选新的选择性COXZ抑制剂提供初步的依据，同时也为这三种常见药物的临床应用开辟新的领域。研究方法:本实验所用HT29细胞为一人大肠癌细胞系，其COXZ为高表达。由浙江大学医学院肿瘤研究所提供。按要求培养细胞，实验时取对数生长期的HT29细胞，制备成单细胞悬液(2 x 105/ml)，接种于96孔培养板中，每孔2 xlo，，置于培养箱中培养，待贴壁完全后进行药物处理实验。按不同浓度梯度加入药物，每一浓度平行6孔，并设空白对照组6孔(不加药品)，TAM板另设溶剂对照孔，取DMSO体积分数为4%、2%各3孔。置培养箱中培养12小时后，以MTT法测定各药物的IC50。按试剂盒说明书要求配置及贮存ELISA测定所需各试剂

关键词：叶绿酸铜钠 HT29 环氧化酶三苯氧胺过表达基因苦参总碱结直肠癌大肠癌细胞系乳腺癌细胞细胞毒作用

过表达SDF-1α促进骨髓间充质干细胞迁移的体外研究

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过表达SDF-1α促进骨髓间充质干细胞迁移的体外研究

作者：王姗姗福建医科大学

学位级别：硕士

目的研究表明,SDF-1/CXCR4轴不仅能够促进移植后的BMSCs向损伤组织迁移,而且具有抑制BMSCs凋亡、增加BMSCs的存活率及增强BMSCs增殖活性等作用,从多方面提高BMSCs向损伤组织的归巢效率。因此我们设想通过转基因技术将外源性SDF-1基因导... 详细信息

目的研究表明,SDF-1/CXCR4轴不仅能够促进移植后的BMSCs向损伤组织迁移,而且具有抑制BMSCs凋亡、增加BMSCs的存活率及增强BMSCs增殖活性等作用,从多方面提高BMSCs向损伤组织的归巢效率。因此我们设想通过转基因技术将外源性SDF-1基因导入BMSCs,提高SDF-1在BMSCs的表达率,从而增强BMSCs的迁移能力。方法1.构建过表达SDF-1α重组慢病毒载体(p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP),进行PCR、双酶切及测序鉴定;2.将已经构建好的慢病毒载体质粒p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP、p NL-IRES2-EGFP、GV-118-SDF-1α-si RNA与其辅助质粒共同转染293T细胞,包装生产慢病毒,并进行病毒浓缩和功能滴度测定;用相同滴度的过表达SDF-1α慢病毒、空载体慢病毒、SDF-1α基因沉默慢病毒转导BMSCs,建立稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系;采用RT-PCR、Western Blot的方法检测三组中SDF-1αm RNA和蛋白的表达水平;***迁移实验检测SDF-1α对BMSCs迁移的影响;抗SDF-1α多抗阻断后观察细胞迁移的变化。结果1、成功构建SDF-1α重组慢病毒载体(p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP质粒)。2、慢病毒转染48h后可在倒置荧光显微镜下观察到大量293T细胞表达EGFP,EGFP阳性率可达95%以上,转SDF-1α基因、空载体及SDF-1α基因沉默BMSCs强烈表达EGFP。RT-PCR、Western Blot证实SDF-1α-BMSCs组过表达SDF-1α,si RNA-BMSCs组SDF-1α表达明显被抑制。3、Transwell迁移实验提示SDF-1α可明显促进BMSCs的跨膜迁移。SDF-1α-BMSCs组及null-BMSCs组在抗SDF-1α多抗作用后迁移指数明显下降,而si RNA-BMSCs组抗体阻断后与阻断前无明显差异。结论利用成功构建过表达SDF-1α基因及SDF-1α基因沉默慢病毒载体包装生产慢病毒,进而感染BMSCs,通过RT-PCR、Western Blot检测SDF-1αm RNA、蛋白的表达水平,证实过表达SDF-1α能增强BMSCs中SDF-1α基因表达,而SDF-1α基因沉默能抑制BMSCs中SDF-1α基因表达,Transwell迁移实验表明,过表达SDF-1α促进BMSCs跨膜迁移,而SDF-1α基因沉默后这种迁移明显被抑制。加入抗SDF-1α后,BMSCs跨膜迁移的细胞数明显减少。

关键词：基质细胞衍生因子骨髓间充质干细胞迁移过表达基因体外实验

家蚕围食膜因子鉴定及其在BmNPV入侵中的功能研究

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家蚕围食膜因子鉴定及其在BmNPV入侵中的功能研究

作者：查绪乐西南大学

学位级别：硕士

昆虫中肠含有一层具有一定弹性和韧性的非细胞结构的半透性膜——围食膜(peritrophin membrane,PM),由中肠上皮细胞分泌形成,在整个中肠区域形成sleeve-like结构。昆虫围食膜的结构复杂,组分多样,其中蛋白质是PM的主要成分。围食膜因子... 详细信息

昆虫中肠含有一层具有一定弹性和韧性的非细胞结构的半透性膜——围食膜(peritrophin membrane,PM),由中肠上皮细胞分泌形成,在整个中肠区域形成sleeve-like结构。昆虫围食膜的结构复杂,组分多样,其中蛋白质是PM的主要成分。围食膜因子是围食膜蛋白中至少含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain,CBD)且能在强变性剂(尿素、盐酸胍等)作用下可被移除的外周蛋白。研究报道围食膜因子在抵抗外源病原物的入侵过程中发挥着重要作用。本研究基于家蚕全基因组数据库,利用同源性搜索和结构域搜索共鉴定了11个围食膜因子基因,并对围食膜因子基因进行生物信息学分析。在信息学分析和基因时空表达分析基础上选定2个在中肠特异表达的围食膜因子Bm001504和Bm009641基因,研究其在外援病原物感染过程中的功能。分析家蚕幼虫食下BmNPV后不同时间点的中肠基因表达,发现Bm001504和Bm009641基因的表达呈显著变化。构建两个基因的过表达载体,检测细胞水平过表达基因后对BmNPV增殖复制的影响,发现过表达Bm001504和Bm009641基因均能抑制BmNPV的增殖复制。在个体水平对Bm001504基因分别敲除和过表达后,检测BmNPV对转基因系家蚕的影响。研究结果如下:1、家蚕围食膜因子的基因鉴定及生物信息学分析本文利用同源性搜索和结构域搜索在家蚕全基因组数据库中共鉴定了40个同源基因。去除3个含Glycoydro8保守结构域的几丁质酶、4个含mucin结构域的肠粘蛋白、3个含Polysacceac保守结构域的几丁质去乙酰基酶、13个含有一个CBD的类围食膜因子表皮蛋白CPAP1以及6个含有3个CBDs的CPAP3后,最终得到11个围食膜因子基因。系统发生分析发现围食膜因子基因中同一基因的不同CBDs多聚为一簇。与赤拟谷盗中围食膜因子基因中CBD的多重序列比对发现半胱氨酸残基之间氨基酸的数目符合以下模式:CX11-17CX5CX9-14CX12CX6-7C。2、家蚕围食膜因子的基因表达利用本实验室已有芯片表达数据对家蚕围食膜因子基因的时空表达模式进行分析,发现Bm001504、Bm009641、Bm011851在幼虫期中肠特异高量表达,且食下感染BmNPV后表达显著上调。RT-PCR结果与芯片表达数据相似。推测Bm009641和Bm001504基因参与BmNPV感染,选定为研究的靶标基因。克隆两个基因全长,其编码氨基酸有信号肽且有多个N-和O-连接糖基化位点。qRT-PCR检测家蚕幼虫食下Bm NPV后基因表达变化,发现Bm001504基因在感染BmNPV6h、8h、12h、24h、72h后上调表达,Bm009641基因在感染BmNPV6h、8h、24h上调表达,显示两个基因可能在BmNPV的入侵中有重要功能。3、家蚕围食膜因子基因在BmNPV入侵中的功能研究分别构建Bm001504和Bm009641基因的真核表达载体,细胞水平过表达Bm001504和Bm009641基因后检测对BmNPV增殖复制的影响,发现处理组与对照组相比,BmNPV增殖复制必需基因ie1、vp39和p10的表达量均显著降低,表明Bm001504、Bm009641基因在细胞水平可抑制病毒的增殖复制。在个体水平过表达和敲除Bm001504基因后,检测转基因系家蚕感染BmNPV后幼虫存活率及对Bm NPV增殖复制的影响,发现过表达Bm001504基因后转基因家蚕幼虫感染BmNPV后的存活率显著升高,病毒关键基因ie1、vp39和p10的表达量显著降低;敲除Bm001504基因后家蚕幼虫感染BmNPV后的存活率显著降低,病毒关键基因ie1、vp39和p10的表达量显著升高。研究发现Bm001504和Bm009641基因在保护家蚕免受外源病原微生物的感染过程中发挥了重要抑制作用,其作用机制有待后续研究。

关键词：家蚕围食膜因子家蚕核型多角体病毒过表达基因敲除基因

产酸克雷伯氏菌2,3-丁二醇高产菌株选育模型的建立与发酵条件的优化

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产酸克雷伯氏菌2,3-丁二醇高产菌株选育模型的建立与发酵条件的优...

作者：程明黑龙江大学

学位级别：硕士

2,3-丁二醇的生产符合绿色化工的要求,目前,2,3-丁二醇的生物法生产成为国内外的研究热点。对野生原始菌株进行改造是提高2,3-丁二醇产量的关键。本研究以实验室保藏的一株克雷伯氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)为出发菌株,通过传统的诱变方... 详细信息

2,3-丁二醇的生产符合绿色化工的要求,目前,2,3-丁二醇的生物法生产成为国内外的研究热点。对野生原始菌株进行改造是提高2,3-丁二醇产量的关键。本研究以实验室保藏的一株克雷伯氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)为出发菌株,通过传统的诱变方法结合现代分子生物学手段,得到—株遗传稳定性良好并且高产2,3-丁二醇的工程菌株,进而通过响应面法对该菌株产2,3-丁二醇摇瓶培养基和发酵条件进行了优化,从而进一步提高2,3-丁二醇的产量。对原始菌株进行多次UV诱变、He-Ne激光诱变、NTG诱变、UV和NTG复合诱变后,利用溶钙圈大小和产物耐受性对突变菌株进行初筛,HPLC法检测2,3-丁二醇产量进行复筛,最终获得了一株编号为KlebsiellaoxytocaU7HN9UN5N2的突变菌株,在未经过优化的条件下,该突变菌株产2,3-丁二醇量达到20.56±0.38g/L,比原始菌株 KO 提高了 30.12%;2,3-丁二醇得率为 0.32±0.76g/g,比原始菌株KO提高了 37.50%。该菌株经过生理生化试验和传代试验结果表明该菌株遗传稳定性良好。以具有2,3-丁二醇代谢途径的Klebsiellaoxytoca为出发菌株,分别PCR扩增到a-乙酰乳酸合成酶(ALS)、α-乙酰乳酸脱羧酶(ADC)、乙偶姻还原酶(AR)三个关键酶基因,分别与克隆载体连接,将重组克隆载体分别转至大肠杆菌中,回收目的基因条带转至多拷贝表达载体中,转化至优良克雷伯氏菌突变株后,使该酶过量表达,从而使碳源更多流向2,3-丁二醇途径。通过强表达产2,3-丁二醇的途径基因的方法,发酵生产2,3-丁二醇的产量有很大提高。采用响应面法对发酵培养基成分及发酵条件进行了优化。PB试验表明葡萄糖、酵母粉、KH2PO4具有显著影响效应;通过中心组合试验对影响产2,3-丁二醇的主要因素进行研究,获得最佳发酵条件:葡萄糖67.82g/L,酵母粉2.312 g/L,K2HPO43.5g/L,KH2PO40.967,(NH4)2SO43.0g/L,初始 pH 值为 7.0,以 5%的接种量接种于装液量为100mL的250mL三角瓶中,发酵6h时添加0.2%的CaCO3,35℃,150r/min振荡发酵48h。在此优化条件下发酵,2,3-丁二醇的产量又提高了35%左右,2,3-丁二醇的产量可达到24.55 g/L。本课题研究,对2,3-丁二醇高产工程菌的构建有一定指导意义。同时,也向2,3-丁二醇的工业化生产迈进了一步。

关键词： Klebsiella oxytoca诱变过表达基因响应面法 2,3-丁二醇

过表达DKK1、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63细胞和相关蛋白的影响

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广州中医药大学学报 2016年第4期33卷 578-584页

作者：万雷黄宏兴黄红柴生颋魏合伟张志海王吉利广州中医药大学附属骨伤科医院广东广州510240 广州中医药大学广东广州510405

【目的】针对Wnt信号通路抑制因子Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)基因构建过表达重组腺病毒载体,观察其对MG63细胞和相关蛋白的影响。【方法】构建DKK1、Sost过表达重组腺病毒载体,将培养好的MG63细胞分为空白对照组、空... 详细信息

【目的】针对Wnt信号通路抑制因子Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)基因构建过表达重组腺病毒载体,观察其对MG63细胞和相关蛋白的影响。【方法】构建DKK1、Sost过表达重组腺病毒载体,将培养好的MG63细胞分为空白对照组、空载病毒组(NC对照组)、过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组5组,根据组别不同分别用上述过表达重组腺病毒感染MG63细胞,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙离子浓度和骨调节蛋白表达情况。【结果】与空白对照组比较,过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组的细胞光密度值、ALP活性值均显著降低,而钙离子浓度显著升高,以过表达DKK1+Sost组变化最明显(P过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组的骨保护蛋白(OPG)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(Lrp)5、骨形态发生蛋白(BMP)2、结缔组织生长因子(CTGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)2、骨桥蛋白(OPN)表达量均降低,而肿瘤坏死因子(TNF)-α表达量则升高,以过表达DKK1+Sost组变化最明显,组间比较差异均有统计学意义(P过表达DKK1、Sost可降低MG63细胞增殖和ALP活性,升高钙离子浓度,对骨调节蛋白有一定影响,尤以两者同时过表达时的作用最强。

关键词： DKK1 Sost 过表达基因腺病毒 MG63细胞细胞培养