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枝霉MD2的转录组测序及两个紫杉醇合成相关候选基因的过表达分析

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枝霉MD2的转录组测序及两个紫杉醇合成相关候选基因的过表达分析

作者：刘盼中南民族大学

学位级别：硕士

紫杉醇（Taxol）是临床应用的高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是获取紫杉醇的重要药源途径之一。目前,已有55个属200多株内生真菌被报道可产紫杉醇,但是真菌中紫杉醇产量低且不稳定,尚无一株可应用于产业化生产。基于真菌紫杉... 详细信息

紫杉醇（Taxol）是临床应用的高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是获取紫杉醇的重要药源途径之一。目前,已有55个属200多株内生真菌被报道可产紫杉醇,但是真菌中紫杉醇产量低且不稳定,尚无一株可应用于产业化生产。基于真菌紫杉醇代谢途径的定向遗传改造,构建稳定高产的基因工程菌株是实现其产业化应用的主要途径之一。筛选真菌中紫杉醇生物合成相关基因,并验证其功能,是阐明真菌紫杉醇合成的分子机制以及构建高产工程菌株的关键。本研究分析了枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides;简称:枝霉）MD2的转录组信息,初步推测了枝霉MD2的紫杉醇合成途径,获得49个与其紫杉醇合成相关的unigenes;克隆了两个候选基因A05868和A02976,分别对其进行了生物信息学分析,构建其过表达载体及转基因菌株,并分析了过表达这两个候选基因对枝霉MD2紫杉烷类合成的影响。主要研究成果如下:1)采用Illumina Hiseq?2500高通量测序技术对枝菌MD2的转录组进行测序并进行系统的生物信息学分析。Trinity de novo组装得到16603个unigenes,分别在NR、NT、PFAM、Swiss Prot、GO、KOG和KEGG数据库进行BLAST注释,共有12479个unigenes至少可在一个数据库进行注释,1593个unigenes可被七个数据库进行注释。8425个unigenes可进行GO功能注释,归属到生物过程、细胞成分和分子功能三大类共57个功能组。3350个unigenes可进行KEGG注释,归属到262个KEGG代谢途径。在此基础上,推测了枝霉MD2中潜在的紫杉醇生物合成途径及其基因信息,包括参与萜类骨架生物合成的9个unigenes和参与紫杉烷类生物合成的40个unigenes。2)克隆了候选基因A05868,该基因DNA和cDNA序列分别为1425 bp和1260 bp;其编码蛋白包含419个氨基酸,与Pseudocercospora fijiensis CIRAD86的溶血磷脂酸酰基转移酶吞蛋白（lysophosphatidic acid acyltransferase endophilin）有57%的一致性,C端有Bin Amphiphysin RVS（BAR）结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A05868并转化枝霉MD2,通过抗性筛选获得14株A05868/MD2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得8株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株（A05868/MD2-A8、B1、B6、C1）进行qRT-PCR分析,发现A05868/MD2-B6转基因菌株的候选基因的表达量最高,为对照（未转基因）菌株的3倍（5天）;进一步提取该菌株的紫杉烷类并进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中未检测到紫杉醇、巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇和多烯紫杉醇4种紫杉烷类物质;而转基因菌株A05868/MD2-B6的10-去乙酰巴卡亭III产量（14.621±0.186μg/g）和10-去乙酰紫杉醇产量（1.564±1.025μg/g）相比对照菌株（18.321±0.045μg/g,3.213±0.063μg/g）分别下降了20.195%和51.323%,该结果初步说明过表达A05868对枝霉MD2的10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇的代谢合成有抑制作用。3)克隆了候选基因A02976,该基因DNA和cDNA序列分别为1685 bp和1518 bp;其编码蛋白包含505个氨基酸,与Fusarium oxysporum的单端孢霉烯3-O-乙酰转移酶（trichothecene 3-O-acetyltransferase）有43%的一致性,C端有转移酶结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A02976并转化枝霉MD2,通过抗性筛选获得14株A02976/MD2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得10株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株（A02976/MD2-A6、A8、C1、D8）进行qRT-PCR分析,发现A02976/MD2-C1转基因菌株的候选基因的表达量最高,是对照菌株的A02976候选基因表达量的3.2倍（10天）。选择A02976/MD2-C1进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中均未检测到紫杉醇、巴卡亭III和多烯紫杉醇3种紫杉烷类物质。转基因A02976/MD2-C1中未检测到10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇,而对照菌株可检测到;转基因A02976/MD2-C1可以检测到7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇,其产量

关键词：枝状枝孢霉MD2 紫杉醇转录组测序候选基因过表达分析

‘西伯利亚’百合LobHLH35的克隆、表达及功能分析

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分子植物育种 2024年

作者：赵国林王有国张济民刘烨贾文杰李想孙亮张小平云南农业大学园林园艺学院云南省农业科学研究院花卉研究所金华职业技术学院农学院

‘西伯利亚’百合(Lilium ‘Siberia’)存在自发休眠的特性，而百合种球自发休眠的现象解除不彻底会给百合切花带来品质差、产量低等问题。bHLH基因家族是功能多样，广泛存在于植物、动物和真菌的转录因子超级家族之一。本研究旨在深入... 详细信息

‘西伯利亚’百合(Lilium ‘Siberia’)存在自发休眠的特性，而百合种球自发休眠的现象解除不彻底会给百合切花带来品质差、产量低等问题。bHLH基因家族是功能多样，广泛存在于植物、动物和真菌的转录因子超级家族之一。本研究旨在深入研究课题组前期转录组筛选得到的一个bHLH基因LobHLH35在‘西伯利亚’百合鳞茎休眠解除中的表达及功能分析。以‘西伯利亚’百合鳞茎为试验材料，依据前期转录组获得的LobHLH35基因序列，利用RT-PCR技术扩增该基因cDNA全长序列，对LobHLH35基因结构、蛋白理化性质等进行分析。然后采用荧光定量PCR测定LobHLH35基因在‘西伯利亚’百合不同组织的表达量和分别通过酵母表达和植物表达体系，分析该基因自激活活性及休眠特性。结果显示LobHLH35基因开放阅读框全长750 bp，包含bHLH结构域，属于bHLH家族基因；该基因编码249个氨基酸残基，编码的蛋白相对分子质量为2.81 kD，理论等电点(pl)为5.12，是不含信号肽和跨膜结构域的不稳定亲水性蛋白；二级结构以α-螺旋为主，三级结构符合二级结构预测结果；系统进化树结果表明该基因与油棕同源基因的氨基酸序列亲缘关系最近，百合鳞茎休眠可借鉴油棕种子打破休眠相关研究；荧光定量PCR结果显示LobHLH35基因在小鳞茎中表达量最高，符合前期该基因主要在百合鳞茎中发挥作用的推测。转录活性分析结果显示LobHLH35基因不具有转录自激活活性，可用于后续试验。异源过表达分析结果显示ABA处理过的过表达拟南芥株系种子萌发时间显著缩短，这表明在一定浓度ABA的胁迫下，LobHLH35可调控植物体休眠。研究结果表明LobHLH35基因可能参与调节植物体内的ABA含量，并与休眠解除存在一定的相关性，推测百合LobHLH35基因可能在鳞茎休眠解除过程中扮演着重要角色。

关键词： ‘西伯利亚’百合(Lilium ‘Siberia’) LobHLH35 休眠功能研究过表达分析

陆地棉NAC转录因子基因GhSNAC1的克隆及其抗旱耐盐分析

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农业生物技术学报 2019年第4期27卷 571-580页

作者：王立国傅明川李浩刘任重柳展基农业部黄淮海棉花遗传改良与栽培生理重点实验室/山东棉花研究中心

NAC (NAM/ATAF/CUC)家族是植物中特有的一类转录因子,其功能涉及植物生长发育调控、激素信号转导、逆境胁迫响应等重要生理过程。本研究利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)技术从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了1... 详细信息

NAC (NAM/ATAF/CUC)家族是植物中特有的一类转录因子,其功能涉及植物生长发育调控、激素信号转导、逆境胁迫响应等重要生理过程。本研究利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)技术从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了1个逆境胁迫响应(stress-responsive) NAC类转录因子基因,命名为GhSNAC1 (GenBank No. KU759894)。该基因长度为1 104 bp,预测编码蛋白含有299个氨基酸,分子量为33.9 kD,等电点为6.18。蛋白序列分析表明,GhSNAC1具有典型的NAC转录因子特征,N端含有保守的NAC结构域。进化分析表明,GhSNAC1与拟南芥(Arabidopsis thaliana) ATAF1 (Arabidopsis transcription activation factor 1)高度相似。qRT-PCR结果显示,GhSNAC1受到干旱、高盐、低温和黄萎病菌(Verticillium dahliae)胁迫诱导,提示该基因可能参与生物和非生物胁迫响应。在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达GhSNAC1,分析干旱或盐胁迫条件下转基因和野生型烟草株系种子的萌发率和幼苗生长差异,实验结果显示,在100 mmol/L NaCl或200 mmol/L甘露醇胁迫下,野生型烟草的种子萌发受到明显抑制,萌发率低于50%,而转基因株系显著优于野生型,其种子萌发率均在80%以上;野生型烟草幼苗弱小,而转基因株系长势强,其单株鲜重和根长分别是野生型的2倍和1.5倍以上。上述结果表明,过表达GhSNAC1可显著提高转基因烟草的抗旱耐盐能力。本研究为深入探究GhSNAC1抗旱耐盐的分子机制提供了基础资料。

关键词：棉花 NAC转录因子干旱盐胁迫过表达分析

二穗短柄草VERNALIZATION1基因的表达特性与初步的功能分析

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二穗短柄草VERNALIZATION1基因的表达特性与初步的功能分析

作者：陈亭山东农业大学

学位级别：硕士

小麦（Triticun aestivum L.）是世界上最重要的粮食作物之一，它的生长发育研究吸引着众多科研人的眼光。在小麦的生长发育中，最为重要的无疑是小麦的成花研究，而春化对小麦等越冬植物的成花具有诱导和促进作用。目前为止，与春化有... 详细信息

小麦（Triticun aestivum L.）是世界上最重要的粮食作物之一，它的生长发育研究吸引着众多科研人的眼光。在小麦的生长发育中，最为重要的无疑是小麦的成花研究，而春化对小麦等越冬植物的成花具有诱导和促进作用。目前为止，与春化有关的相关基因有很多，比如VRN1、VRN2、VRN3以及VRT2等，而其中VRN1是小麦响应春化的关键基因，因此了解VRN1的特性及功能对研究小麦的春化机理及其生长发育显得至关重要。虽然以小麦为材料研究VRN1基因的功能会比较直接，但小麦是六倍体的大田作物，其生长周期长、基因组大、重复序列高、遗传转化困难，导致现阶段小麦中VRN1所介导的春化机制尚未完全确定。而二穗短柄草作为一种新型的禾本科模式材料，具有生长周期短、易转化、与麦类作物亲缘关系近等特点，因此本实验选取二穗短柄草Bd21生态型为实验对象展开研究。在二穗短柄草Bd21生态型中，我们找到了麦类作物VRN1基因的同源基因BdVRN1，对基因的表达特性和功能进行了初步分析：（1）通过对BdVRN1的基因组的结构分析表明，BdVRN1位于二穗短柄草的1号染色体，编号Bradi1g08340.1，BdVRN1的基因组含有8个外显子和7个内含子，全长9832bp，值得注意的是，BdVRN1的基因组具有一个与麦类作物开花相关基因类似的较大的第一内含子。（2）通过对BdVRN1的氨基酸序列分析表明，BdVRN1的cDNA全长为732bp，编码243个氨基酸，BdVRN1属于典型的与开花时间相关的MADS-box基因家族，BdVRN1与小麦VRN1及拟南芥中与小麦VRN1同源的AP1进行氨基酸序列比较，发现三者在MADS-box和K-box区域同源性较高，证明这两个功能结构域比较保守，而3′端则相对特异。（3）通过对BdVRN1在长短日照下的表达特性分析表明，在长日照条件下，BdVRN1的表达量随着植株的生长逐渐提高，而在短日照条件下BdVRN1始终处于一个较低水平，说明BdVRN1的表达受到光周期的影响。（4）通过对BdVRN1在春化条件下的表达分析表明，春化条件下，BdVRN1的表达量随着春化时间的延长而逐渐提高，放回温室后，长短日照下BdVRN1的表达量均出现一定水平的下降，但BdVRN1在长日照下的表达量依旧高于其在短日照条件下的表达量。表明BdVRN1的表达受春化和光周期的双重影响。（5）通过对BdVRN1的昼夜节律性的分析表明，不管在长日照还是在短日照条件下，BdVRN1的表达均呈现一定的规律性，在进入光照后BdVRN1的表达量呈现一定程度的上升，在进入光照10小时左右达到最高，随后表达量下降，表明BdVRN1的表达具有一定的昼夜节律性。（6）通过对Bd21不同部位中BdVRN1的表达分析表明，在二穗短柄草Bd21生态型的叶、茎、尖中均发现有BdVRN1的表达，且春化后表达量均有所提升，其中春化后的茎尖中BdVRN1的表达量提升的最为明显。（7）通过对BdVRN1基因的功能进行分析表明，在过表达BdVRN1时，二穗短柄草Bd21呈现极度早花的现象，而且早花植株中花器官的构成与野生型是一致的，说明过表达BdVRN1在一定程度上可以促进植物开花，但不会明显影响植物花器官的发育，进而说明BdVRN1是一个单纯促进植物开花而不影响花器官发育的基因。但是早花植株无法正常结实，经过分析发现早花植株的花药无法和野生型花药一样进行正常散粉，我们推测这是导致过表达BdVRN1所产生的早花植株无法正常结实的根本原因。（8）在水稻ZH11中过表达BdVRN1时，未发现水稻出现极度早花现象，在花器官的构成上，转基因水稻跟野生型ZH11也是一致的，而且还可以正常结实。说明BdVRN1所介导的开花通路在水稻中是行不通的。我们推测，BdVRN1所介导的这条通路可能是在进化过程中，温带禾本科所形成的一种新型的开花通路。

关键词：二穗短柄草 BdVRN1 开花时间过表达分析水稻

胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育恢复基因的克隆及功能分析

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胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育恢复基因的克隆及功能分析

作者：郝卫东中国农业科学院

学位级别：硕士

胡萝卜是世界十大蔬菜作物之一,富含胡萝卜素,具有很高的食用和经济价值。瓣化型细胞质雄性不育是胡萝卜商业化制种的主要途径,可培育出完全不育的一代杂交品种,但也限制了优异种源的共享。瓣化型细胞质雄性不育恢复系可打破这一利用屏... 详细信息

胡萝卜是世界十大蔬菜作物之一,富含胡萝卜素,具有很高的食用和经济价值。瓣化型细胞质雄性不育是胡萝卜商业化制种的主要途径,可培育出完全不育的一代杂交品种,但也限制了优异种源的共享。瓣化型细胞质雄性不育恢复系可打破这一利用屏障,但实现后代完全恢复的资源材料报道鲜少。本课题基于多年资源收集和分离,筛选出了1份恢复系材料17166C,并初步将Rf1定位于9号染色体上物理距离为1.02 Mb两个In Del标记之间。本研究在此基础上扩大瓣化型不育系P25A和恢复系17166C所构建的F群体,对育性恢复基因Rf1进一步进行精细定位,克隆相关候选基因,并进行功能分析,为深入研究瓣化型雄性不育恢复机制奠定重要基础,同时为有效利用优异不育种源提供技术支撑和理论依据。主要研究结果如下:1.通过对恢复系17166C与5个高代不育系、2个引进品种（完全不育）杂交后代进行育性调查,结果表明17166C分别与P52A、Y22的杂交后代育性恢复比例为74%和99%,其它5个杂交后代的育性均100%恢复,这与先前研究结果一致,17166C中Rf1为显性基因,可对不同基因型瓣化雄性不育源实现有效育性恢复。2.本研究以不育系P25A和恢复系17166C构建了包含363个单株的F群体,在前期定位区间新开发了5个SNP标记,Rf1定位在SNP-3252457和In D-3487954之间,遗传距离为3.48 c M,对应9号染色体上的物理位置为3.25Mb-3.48Mb,物理距离为0.23 Mb。***1定位区间内含有23个基因,结合候选基因功能注释分析,进一步明确候选区间内存在6个PPR基因。系统发育分析显示,6个PPR基因和拟南芥的育性恢复基因RPF2、RPF3聚为一类,其中LOC108201831（PPR1831）和RPF2进化关系最为接近,与其它PPR基因亲缘关系较远。通过对6个PPR基因克隆,发现LOC108201831在P25A和17166C亲本之间存在多处序列差异。进一步克隆了3份保持系和2份自交系的LOC108201831,序列与不育系P25A一致,不同于恢复系17166C,初步推测LOC108201831可能为Rf1的候选基因。4.利用P25A的下胚轴作为外植体,在1 mg/L 2,4-D+1 mg/L 6-BA的B5培养基中进行愈伤诱导。将17166C中LOC108201831的CDS序列构建到p CAMBIA2300＿35S＿YFP-HA-revised表达载体上,通过农杆菌介导转化到P25A愈伤组织中,在50、75、100 mg/L的Kana筛选下共获得了1032个阳性愈伤组织,阳性愈伤比例为87%。在B5培养基中诱导分化获得了153个再生植株,通过鉴定,获得了63个阳性株系,阳性比例为41%。5.以恢复系17166C为阴性对照,过表达结果表明不同阳性苗的相对表达量为阴性对照的2倍到10倍不等。目前观察到的6株阳性苗的表型均为雄性不育表型,有待进一步的观察鉴定。

关键词：胡萝卜育性恢复基因克隆遗传转化过表达分析

PriorGene Suite：人类复杂疾病相关候选基因优选与通路富集分析的工具

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PriorGene Suite：人类复杂疾病相关候选基因优选与通路富集分析...

作者：方忠海天津医科大学

学位级别：硕士

研究目的:随着基因组学及相关高通量技术的发展,我们从分子层次探索人类复杂疾病及相关生物学过程机理的能力越来越强,与此相应,也积累了大量与各种疾病相关的基因及其功能的信息。然而,对特定疾病而言,由不同技术及方法所确定的基因,... 详细信息

研究目的:随着基因组学及相关高通量技术的发展,我们从分子层次探索人类复杂疾病及相关生物学过程机理的能力越来越强,与此相应,也积累了大量与各种疾病相关的基因及其功能的信息。然而,对特定疾病而言,由不同技术及方法所确定的基因,其中大多数可能在疾病的发病或发展过程中只起到较小或间接的作用,只有少数基因与其具有密切的关联。因此,在疾病的研究中,如何整合由不同研究人员利用不同平台和技术所积累的与之相关的候选基因信息,从数目众多的候选基因中筛选出关联程度最优的基因集,并从系统的层次探索其功能以揭示疾病发生发展的分子机理,依然是复杂疾病研究中面临的挑战。近年来,尽管已经开发了许多计算方法以解决这些问题,但它们均存在一定的缺陷或局限性。因此,针对复杂疾病的特点,开发出更有效的候选基因优选方法和相应的基因功能分析工具具有重要的意义。研究方法:***:候选基因优选本研究通过收集整合不同研究类别的疾病相关候选基因,利用最优化算法给不同研究类别分配合理权重来度量不同研究类别对度量该研究类别中的基因与该疾病表型的相关性的贡献程度,再根据候选基因的综合得分和我们设定的阈值,最终筛选出一组最优的与疾病相关的基因集合。同时,我们对所优选的基因进行了功能富集分析并确定其中显著富集的生物学通路。并且,利用受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)比较分析了不同基因优选工具PriorGene、GLAD4U、Phenolyzer和GeneCards的优选结果。***:通路富集分析考虑到真实的生物学通路中不同基因的所起的作用并不等价,我们构建了基于基因之间相互作用信息通路富集分析工具。该方法基于如下假设:在给定通路中,相比通路之外的基因,如果一个基因更倾向于与通路中的基因相互作用,那么它在这个通路中可能具有较重要的功能。这种关联特性可以利用超几何抽样模型来估计,从而给通路里的基因分配权重,并将基因的权重整合到右尾Fisher精确概率检验来计算不同生物学通路富集的显著性。研究结果:1.候选基因优选我们从关联研究、连锁分析、基因表达谱分析和文献搜索这四个研究来源分别得到了278、2158、694和1635个与精神分裂症相关的候选基因。以基因的综合得分0.653为阈值筛选了267个基因作为最终优选的结果,称之为精神分裂症相关的基因(Schizophrenia-related genes,SCZgenes)。功能富集分析发现,很多与神经发育,突触传递,神经信号传导相关的生物学过程在SCZgenes中显著性富集。例如,突触传递、调控神经冲动传递、谷氨酸信号通路、细胞表面受体连接的信号转导、G蛋白偶联受体蛋白信号通路等Gene Ontology生物学过程条目。同时还有一些生物学过程与药物反应,认知和记忆相关。而通路富集分析的结果则显示大部分显著富集的通路都是与神经功能或药物成瘾相关的。例如,多巴胺能神经突触,谷氨酸能神经突触,5-羟色胺能神经突触,可卡因成瘾,安非他明成瘾,尼古丁成瘾,酒精成瘾。ROC曲线比较分析不同工具的优选结果则显示曲线下面积(Area Under the Curve,AUC),AUC(0.939)>AUC(0.917)>AUC(0.903)>AUC(0.793)。2.通路富集分析通过利用特定的检索词在PUBMED中检索并筛选出与尼古丁或吸烟成瘾和吸烟起始相关的研究报道,得到了177个与尼古丁成瘾相关的基因(nicotine addiction-related genes,NAgenes)和34个与吸烟起始相关的基因(smoking initiation-related genes,SIgenes)。利用过表达分析(Over-representation analysis,ORA)和基于网络的基因加权过表达分析方法对NAgenes和SIgenes进行通路富集分析,结果显示大部分显著性富集的通路是与神经系统相关的,这与先前的研究结果一致,并且基因加权过表达分析方法能够检测出更多真实与该疾病表型相关的通路。研究结论:1.本研究中功能和通路富集分析的结果与已有的试验研究结果一致性较高,说明了PriorGene优选出的精神分裂症相关的基因是可信的,可以作为进一步研究精神分裂症分子机理的候选基因。***曲线比较分析了PriorGene与GLAD4U、Phenolyzer和GeneCards对精神分裂症候选基因的优选结果,通过比较每条曲线的AUC值可以得出PriorGene的优选结果最好。3.精神分裂症是影响神经系统功能的复杂疾病。药物成瘾可能与精神分裂症存在因果关系,而精神分裂症可能会直接或间接影响学习、认知和记忆等高级神经生物学过程。4.本研究得到了比较可靠的NAgen

关键词：基因优选通路富集分析模拟退火基因加权过表达分析

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一个水稻bHLH转录因子的反向遗传学分析

天津师范大学学报（自然科学版） 2015年第2期35卷 67-70页

作者：孙琼琳罗倩宋婷李莹莹栾维江天津师范大学生命科学学院天津300387 天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室天津300387

b HLH类型转录因子对于植物开花具有重要的调控作用.为了揭示b HLH转录因子在短日照植物水稻中的功能,利用反向遗传学方法构建了水稻Osb HLH1基因过表达载体,获得过表达转基因植株,分析目的基因在过量表达条件下的功能.结果表明:过表达O... 详细信息

b HLH类型转录因子对于植物开花具有重要的调控作用.为了揭示b HLH转录因子在短日照植物水稻中的功能,利用反向遗传学方法构建了水稻Osb HLH1基因过表达载体,获得过表达转基因植株,分析目的基因在过量表达条件下的功能.结果表明:过表达Osb HLH1能够导致水稻的抽穗期推迟;Osb HLH1在水稻中的表达还具有光周期昼夜节律性,无论是在长日照还是在短日照条件下,Osb HLH1都在夜间具有表达高峰.组织特异性表达结果表明:Osb HLH1在水稻的不同器官中都有表达,但在叶片中表达较高,与光周期相关基因的表达吻合.

关键词：水稻转录因子bHLH OsbHLH1基因光周期过表达分析

内源性小分子ITE影响胶质瘤细胞的迁移及增殖的机制研究

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内源性小分子ITE影响胶质瘤细胞的迁移及增殖的机制研究

作者：舒秋婷内蒙古农业大学

学位级别：硕士

目前胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)免疫治疗的的热点之一是阻断色氨酸(tryptophane,Try)代谢为犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)的途径,即抑制吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)/色氨酸-2,3-双加氧酶(Tryptophan-2,3-dioxygenase,TDO)途径,犬尿氨酸结合芳烃受体(aryl hydro carbon receptor,AhR),抑制免疫。设想AhR的一种内源性高亲和力配体ITE可与犬尿氨酸竞争性结合AhR,阻断这条通路。在实验前期表明ITE可以抑制GBM的迁移、侵袭和增殖。选取两种常用的胶质瘤细胞系U87MG和GL261,发现ITE对U87MG增殖无显著影响,对GL261有促进细胞增殖的趋势。延时摄影提示ITE可以降低细胞粘附性。此外,通过免疫荧光观察β-肌动蛋白束的变化,发现*** ITE显著减少了细胞边缘稳定的丝状伪足的数量,提示丝状伪足尖端与胶原基质的粘附减弱,但其抑制GBM侵袭的机制尚不明确。分析ITE处理后的U87MG和GL261转录组数据,发现fold change>4的Novel基因中多数有转座子,提示ITE可能是通过AhR影响转座子来调控基因表达。进一步研究发现与增殖相关的基因CDK4和PRMT5在U87MG中受ITE影响下调的蛋白复合体中富集,但在GL261中没有显著富集。Real-Time PCR验证了 CDK4和PRMT5的相应变化,发现使用ACTB单一内参发现两者的变化符合转录组数据,使用HPRT、GAPDH和ACTB三种内参时PCR结果与转录组结果有差异。但两结果均可部分解释了观察到的增殖差异现象,提示示ITE-AhR对人鼠胶质瘤细胞增殖相关通路作用不同。我们还对受ITE调控的基因进行了通路和基因本体(gene ontology,GO)富集以及蛋白互作/蛋白复合体的分析,同时进行了mRNA-miRNA整合分析。发现,不同的转录组分析策略提供了互补的信息,受ITE调控的U87MG和GL261转录组数据虽有相同之处,也有较大差异,提示利用细胞系模型做科学研究时要综合多种模型的分析结果,谨慎将鼠实验模型数据外推到人临床反应。本研究可为后续胶质瘤模型及外推临床反应的研究提供参考。

关键词：神经胶质瘤 AhR ITE 转座子 U87MG GL261 迁移增殖过表达分析 Wilcoxon富集分析 mRNA-miRNA整合分析 CDK4 PRMT5

利用cDNA-AFLP技术筛选甘蓝型油菜应答非生物胁迫的差异表达基因

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利用cDNA-AFLP技术筛选甘蓝型油菜应答非生物胁迫的差异表达基因

作者：刘翠翠福建农林大学

学位级别：硕士

甘蓝型油菜(BrassicanapusL)是我国很重要的经济作物之一,虽然中国是最大的油菜生产国,但是在提高油菜产量上仍然面临着很多问题和挑战。长江中下游地区是我国种植油菜的主要产地,由于恶劣环境的影响,该地区经常会发生季节性干旱甚至冻... 详细信息

甘蓝型油菜(BrassicanapusL)是我国很重要的经济作物之一,虽然中国是最大的油菜生产国,但是在提高油菜产量上仍然面临着很多问题和挑战。长江中下游地区是我国种植油菜的主要产地,由于恶劣环境的影响,该地区经常会发生季节性干旱甚至冻害等自然灾害,造成油菜大面积的减产,因此培育高抗逆的油菜品种,是提高我国油菜产量的一个重要途径,挖掘油菜逆境应答基因,尤其是可以同时应答几种不同逆境胁迫的基因,了解植物抵抗逆境胁迫的分子机制,对油菜的抗逆育种具有重要的意义。植物响应各种逆境胁迫的分子机理,一般体现在基因转录表达水平调节上,因此通过研究基因在转录水平上的表达差异情况,来筛选抗逆候选基因,是挖掘抗逆基因,研究抗逆机理从而筛选高抗逆作物栽培品种常用的一种科研手段。本实验以高油、高产且抗病性强的甘蓝型油菜“中双11号”为实验材料,利用cDNA-AFLP技术分析极端温度胁迫后的油菜叶片内转录组的差异表达情况,通过差异表达基因片段的测序及数据库比对分析,找出极端温度胁迫下油菜叶片内差异表达基因,并从中筛选了 36个重复性好、差异表达明显,同源序列比对相似度接近100%的差异表达基因,根据基因序列设计特异性PCR引物,利用半定量RT-PCR技术进一步筛选响应盐、干旱和水淹胁迫的差异表达基因;同时,选出两个响应高温胁迫差异表达明显且测序质量好的基因进行基因克隆与在拟南芥中超表达分析。主要结果如下:1.极端温度胁迫下甘蓝型油菜叶片差异表达基因的分析通过cDNA-AFLP分析,利用256个引物组合在油菜叶片内共发现了 9728 个转录衍生片段(Transcript-derived fragments,TDFs),每个引物组合得到AFLP扩增条带约10-55条(平均38条),大小在50-700bp之间不等。虽然大部分扩增条带在高、低温胁迫后没有明显差异变化,但仍检测到585个差异表达基因(Differentially expressed gene,DEG)片段,其中响应高温胁迫的有361个,响应低温处理的有328个,同时响应高低温处理的有104个。通过测序然后在 NCBI、Brassica napus Genome Browser、TAIR 和 Brassica Database等公共数据库进行比对分析发现,有47个DEG片段同时被两个或多个引物组合多次检测到,除去重复后共获得538个无冗余基因片段序列,其中有445个DEG片段在数据库中找到了同源序列(相似度>80%),剩下93个DEG片段没在数据库中比对到同源序列。对这445个DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析发现,其中有102个(22.92%)DEGs编码具有酶调节活性蛋白;45个(10.11%)编码具有ATP绑定功能的蛋白;34个(7.64%)编码具有蛋白绑定功能的蛋白;25个(5.62%)编码具有激酶活性的蛋白;25个(5.62%)编码具有转录因子活性的蛋白;23个(5.17%)编码具有金属离子绑定功能的蛋白;19个(4.27%)编码具有转运活性的蛋白;14个(3.15%)编码具有E3泛素蛋白连接酶活性的蛋白其余低于3%的DEG类型还有编码DNA绑定、RNA绑定、锌离子绑定、钙离子绑定、核酸、GTP绑定,碳水化合物绑定等功能的蛋白,以及编码具有分子结构活性、信号转导活性的蛋白、翻译起始因子、锌指蛋白等。还有10个DEGs编码热休克蛋白、2个编码低温诱导蛋白。此外,56个(12.58%)DEGs编码了其他功能的蛋白,96个(21.57%)DEGs的功能尚属未知。以上所述DEGs中,个别成员编码的蛋白质同时具有几个功能。亚细胞定位分析发现,有85个(19.10%)DEGs被定位在核内,61个(13.71%)被定位在叶绿体内,48个(10.79%)被定位在细胞膜上,45个(10.11%)被定位在胞液内,44个(9.89%)被定位在细胞质内,27个(6.0707%)DEGs被定位在胞外区内,26个(5.84%)DEGs被定位在线粒体内,24个(5.39%)DEGs被定位在叶绿体基质内,19个(4.27%)DEGs被定位在细胞壁上,15个(3.37%)DEGs被定位在类囊体膜上,另外有低于3%的DEGs,经过定位分析分别被定位在液泡膜上、高尔基体上、内质网上、质外体内以及光系统Ⅱ上,同时有158个(35.51%)DEGs的亚细胞定位尚未明确。以上所述DEGs中,有些DEGs被预测同时存在于细胞的多个场所。2.36个DEGs在盐、干旱和水淹胁迫下的甘蓝型油菜叶片中的表达模式分析从基于cDNA-AFLP方法获得的差异表达基因中,筛选36个应答极端温度胁迫差异表达明显且测序质量好的DEGs,分别设计PCR引物,利用半定量RT-PCR技术对其在盐、干旱和水淹胁迫下甘蓝型油菜

关键词：甘蓝型油菜非生物胁迫 cDNA-AFLP 差异表达基因过表达分析