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热带作物学报 2012年第2期33卷 342-345页

作者：王健华章绍延龚殿张雨良刘志昕海南大学环境与植物保护学院海南儋州571737 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海南海口571101

辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)是2007年在辣椒上发现的病毒新种,是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种。笔者于2009年首次在海南黄灯笼辣椒上检测发现ChiRSV。根据ChiRSV保守区域设计和筛选PCR特异引物,优化退火温度,对PC... 详细信息

辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)是2007年在辣椒上发现的病毒新种,是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种。笔者于2009年首次在海南黄灯笼辣椒上检测发现ChiRSV。根据ChiRSV保守区域设计和筛选PCR特异引物,优化退火温度,对PCR产物进行序列测定,建立了ChiRSV的RT-PCR检测方法。通过灵敏度测定,结果表明该方法最低可检出12.5 pg病毒RNA,灵敏度高。通过对来自海南田间的疑似辣椒病样的RT-PCR检测,证实了该方法有良好的反应特异性,亦表明ChiRSV可能已在海南扩散。

关键词：辣椒环斑病毒分子检测黄灯笼辣椒

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辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备

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热带作物学报 2013年第3期34卷 534-537页

作者：章绍延王健华谭老喜周朋张雨良刘志昕海南大学环境与植物保护学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点开放实验室海南海口571101 海南大学农学院海南海口571101

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的... 详细信息

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的抗血清经间接法酶联免疫吸附测定(ID-ELISA),效价高达1∶125 000,且特异性高,与黄灯笼辣椒中另一种亲缘关系很近的同属病毒辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)不发生血清交叉反应、可有效鉴别这2种Potyvirus病毒。获得的抗血清可用于ChiRSV的检测及后续实验,最适工作浓度在1∶5 000～1∶25 000之间。

关键词：辣椒环斑病毒提纯多克隆抗体酶联免疫吸附测定

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辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus）全基因组克隆及序列分析

辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus）全基因组克隆及序列分析

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作者：龚殿海南大学

学位级别：硕士

黄灯笼辣椒（Capsicum chinense Jacp.）是海南特有的辣椒品种,极易感染病毒病。目前,病毒病已成为黄灯笼辣椒减产的首要病害,严重影响了其经济效益,极大地制约了海南辣椒产业的发展。辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus, ChiRSV... 详细信息

黄灯笼辣椒（Capsicum chinense Jacp.）是海南特有的辣椒品种,极易感染病毒病。目前,病毒病已成为黄灯笼辣椒减产的首要病害,严重影响了其经济效益,极大地制约了海南辣椒产业的发展。辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus, ChiRSV）于2007年在越南首次被发现,全基因组序列尚未报道,GenBank中仅报道了两个ChiRSV越南分离物（ChiRSV-VN/C8, ChiRSV-VN/C9）基因组3’端长约1.6kb的核苷酸序列（DQ925438, DQ925439）, ICTV于2009年将ChiRSV划为马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的确定种。本研究以采自海南陵水英州的黄灯笼辣椒病毒病样品为对象,提取其叶片总RNA后,利用RACE法和基因组步移法（Genomic walking method）成功获得辣椒环斑病毒英州分离物（ChiRSV-HN/Yingzhou）的全基因组序列（JQ234922）,从而首次在世界上报道了ChiRSV的全基因组序列,通过分析确立了其在生物进化史上的地位,为抗病毒基因工程打下了基础。具体内容为： 1)采用3’RACE方法,克隆出ChiRSV-HN/Yingzhou基因组的3’端序列,共1571bp。序列分析结果表明,该序列包含完整的CP基因,且CP氨基酸与辣椒环斑病毒两个越南分离物（DQ925438, DQ925439）的一致性分别达94%和93%。根据国际病毒分类委员会（ICTV）第八次报告中的马铃薯Y病毒属定种标准,初步判定克隆到的序列为ChiRSV基因组的3’端序列。 2)采用基因组步移法克隆ChiRSV-HN/Yingzhou基因组除末端以外的序列。每次步移的上游引物根据马铃薯Y病毒属基因组的保守序列设计,下游引物根据上一次步移获得的序列设计,依此共设计出6对引物,克隆到6个片段,大小分别为1193bp、2185bp、1585bp、1426bp、871bp、2113bp。 3)采用5’RACE方法,克隆出ChiRSV-HN/Yingzhou基因组的5’端序列,共74bp。根据片段间的重叠序列,将上述5’端、通过基因组步移法克隆的6个片段及3’端的序列进行拼接,得到完整的ChiRSV-HN/Yingzhou全基因组序列,共9615bp。 4)序列分析发现,ChiRSV-HN/Yingzhou基因组的5’-非编码区（5’-UTR）和3’-非编码区（3’-UTR）分别为194bp和181bp,存在一个大的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个分子量为349.1kD且由3079个氨基酸聚合而成的多聚蛋白,该多聚蛋白后期会被裂解成10个小的多肽。Pretty Interesting Potyviridae ORF （PIPO）起始于AAA密码子（2957～2959bp）,而非常见的AUG密码子,终止于UAG密码子（3137～3139bp）,编码一个分子量为6.6kD且由60个氨基酸聚合而成的多肽。 5)聚类分析及系统进化树分析结果表明,ChiRSV-HN/Yingzhou与烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus, EF219408）的亲缘关系最近,它们的基因组在核苷酸和氨基酸水平的一致性最高,分别为64.8%和68.7%,这为进一步证实ChiRSV是马铃薯Y病毒属的确定种提供了证据。

关键词：黄灯笼辣椒辣椒环斑病毒全基因组基因组步移法序列分析马铃薯Y 病毒属

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辣椒环斑病毒侵染性克隆构建及L-半胱氨酸抗病毒技术研究

辣椒环斑病毒侵染性克隆构建及L-半胱氨酸抗病毒技术研究

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作者：华梦滢宁波大学

学位级别：硕士

辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,Chi RSV)于2008年在越南首次被报道,在2009年被分类为一种特别的马铃薯Y病毒属病毒。它的寄主范围很广,能够侵染好些重要的经济作物,包括辣椒、番茄、烟草和瓜类蔬菜等。Chi RSV侵染植株主要表现出... 详细信息

辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,Chi RSV)于2008年在越南首次被报道,在2009年被分类为一种特别的马铃薯Y病毒属病毒。它的寄主范围很广,能够侵染好些重要的经济作物,包括辣椒、番茄、烟草和瓜类蔬菜等。Chi RSV侵染植株主要表现出叶片皱缩、叶脉间环斑等症状,对辣椒的品质造成严重影响。本研究在前期实验室辣椒病毒病调查的基础上,通过5'和3'RACE技术获得了Chi RSV-YN/Wenshan的全基因组序列,Chi RSV-YN/Wenshan与海南、湖南分离物的核苷酸同源性为88.5-98.9%,多聚蛋白的氨基酸同源性为93.0-99.3%。Chi RSV-YN/Wenshan与海南、湖南分离物的P1存在较大差异,氨基酸同源性为76.6-79.2%。利用MUSCLE将Chi RSV分离物和亲缘关系较近的potyvirues全基因组序列进行比对,RDP4分析表明Chi RSV-YN/Wenshan未发生重组。为研究Chi RSV的生物学特性,构建其全长c DNA侵染性克隆(p Chi RSV),利用农杆菌介导法侵染本氏烟,10天后系统叶出现明显皱缩症状,RT-PCR、Western blot确认病毒发生系统侵染,透射电镜观察到典型的线条状病毒粒子。Chi RSV侵染的本氏烟病汁液摩接朝天椒和小米辣,15天后系统叶分别出现皱缩和花叶症状。为研究湖南、海南分离物P1蛋白差异与病毒侵染的关联,基于p Chi RSV分别构建p Chi RSV-Hu N-P1、p Chi RSVHai N-P1突变体,结果表明系统叶病毒积累量依次为p Chi RSV>p Chi RSV-Hai NP1>p Chi RSV-Hu N-P1。为便于观察Chi RSV侵染情况,在NIb和CP之间插入GFP蛋白,本氏烟侵染表明p Chi RSV-GFP可发生系统侵染,病汁液摩接朝天椒,系统叶可观察到绿色荧光,表明p Chi RSV-GFP在本氏烟和辣椒上均具有侵染活性。前期通过20种氨基酸体外抑制实验,筛选到L-Cysteine可影响Chi RSV的病毒粒子稳定性,浓度梯度处理表明,>2.5%L-Cys体外可实现病毒外壳蛋白(coat protein,CP)降解,利用Molecular docking预测表明,L-Cys与Chi RSV-CP的Met139和Val137可形成氢键。为确认L-Cys与Chi RSV-CP的结合位点,构建Met139、Val137的单点突变以及双突变,基于TVCV骨架构建嵌合体病毒载体(p GT-Chi RSV-CP-Met139/Val137/Met139Val137),农杆菌介导本氏烟侵染,结果显示p GT-Chi RSV-CP以及各突变体均能发生系统侵染并表达CP蛋白。投射电镜观察显示,仅p GT-Chi RSV-CP形成病毒粒子。p JP603-Chi RSV-CP/Met139/Val137/Met139Val137结果表明,突变体蛋白未发生明显亚细胞定位改变,Western blot结果表明,单点和双突变蛋白表达量显著低于野生型CP。综上所述,Met139和Val137与Chi RSV-CP蛋白的稳定性有关。

关键词：辣椒环斑病毒马铃薯Y病毒侵染性克隆 P1 L-半胱氨酸

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马铃薯Y病毒属病毒通用RT-PCR检测方法的建立及应用

马铃薯Y病毒属病毒通用RT-PCR检测方法的建立及应用

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作者：章绍延海南大学

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),是最大的RNA病毒属。根据ICTV最新分类标准,Potyvirus包含确定种146个、暂定种32个,是十分重要的植物病原,引起很多农作物和经济作物严重病害。自20世纪90年代初,陆续有文章报... 详细信息

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),是最大的RNA病毒属。根据ICTV最新分类标准,Potyvirus包含确定种146个、暂定种32个,是十分重要的植物病原,引起很多农作物和经济作物严重病害。自20世纪90年代初,陆续有文章报道该属病毒通用检测方法的建立及运用。但近年来,随着该属病毒种类的不断发现及其基因组测序的相继完成,原先用于设计引物的保守序列并不能适用于所有potyviruses,而使某些病毒无法检出,使检测准确度和适用性大大降低和减小。为了建立快速、灵敏、适用性广的Potyvirus通用RT-PCR检测方法,本研究对具有代表性的该属病毒进行序列同源比对,在NIb中部和CP末端分别搜索到一处保守位点,设计简并引物PotyF:5'-GTITGYGTKGAYAYTTYAAYAA-3';PotyR:5'-GTRT GBCKYTCIGTRTYYTC-3'.利用设计的引物,结合引物比例、浓度优化,建立了基于Touch-down PCR技术的检测方法。检测方法评估结果表明,该检测方法能对8种供试的potyviruses进行检测,与13种供试的常见植物无交叉反应,通用性好、特异性高,具有一定的灵敏性。利用建立的检测方法,对15个病毒疑似样品进行检测,检测出阳性样品5个。对阳性检测结果进行克隆测序,并利用BLAST比对进行病毒鉴定,从而鉴定出1种新病毒、2种病毒新寄主、3个病毒新株系和1个重组事件等。具体研究结果如下：1.感染澄迈水茄的potyvirus为水茄花叶病毒(Wild tomato mosaic virus, WTMV),与越南水茄上的WTMV-Laichau同源性最高,核苷酸、氨基酸序列同源性分别为91.1%、93.3%。感染贵州水茄的potyvirus为烟草脉带花叶病毒(Tobacco veinal binding mottle virus, TVbMV),与云南烟草上的TVbMV-YN9.1同源性最高,核苷酸、氨基酸序列同源性均为99%。这是TVbMV自然侵染水茄的首次报道。2.感染澄迈曼陀罗的potyvirus为辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus, ChiRSV)的2个新株系。2株系均与ChiRSV-HN/14分离物同源性最高,核苷酸同源性分别为80%、83%,氨基酸同源性依次为88%、91%。这是ChiRSV自然侵染曼陀罗的首次报道。利用ChiRSV CP简并引物对两株系CP及其侧翼序列进行测序,发现2株系CP3’末端倒数6-8位3碱基存在缺失而引起的移码,并终止于TGA。通过构建进化树、RDP分析,首次发现ChiRSV存在重组。2株系中与ChiRSV-HN/14同源性较高的ChiRSVRec是由另一个株系ChiRSVD和黄灯笼辣椒上的ChiRSVC株系重组产生的。3.该曼陀罗样品还同时感染Chilli veinal mottle virus (ChiVMV).利用分段克隆和RACE技术对该ChiVMV分离物进行了全基因组克隆,获得具有典型Potyvirus特征的部分基因组序列8067bp(不计PolyA尾)。通过CP核苷酸和氨基酸序列BLAST分析、CP和全基因组进化树构建表明该分离物是一个与已报道的ChiVMV株系差异较大的新株系。4.感染海口茉莉的potyvirus为茉莉T病毒(Jasmine virus T, JaVT)。利用分段克隆和RACE技术对该JaVT分离物进行全基因组克隆,获得具有典型Potyvirus特征的部分基因组序列8749bp(不计PolyA尾)。CP基因BLAST分析表明,该分离物与JaVT的同源性最高,核苷酸、氨基酸序列同源性分别为91%和96%。通过构建CP进化树,发现该病毒与薤花叶病毒(Scallion mosaic virus,ScaMV)和水仙晚期黄化病毒(Narcissus late season yellows virus, NLSYV)亲缘关系最近。5.感染海口长春花的potyvirus为一种新病毒,暂命名为长春花脉斑驳病毒(Catharanthus veinal mottle virus, CaVMV)。利用分段克隆和RACE技术对该新病毒进行全基因组克隆,获得接近全基因组序列9243bp(不计PolyA尾)。该序列具有典型的Potyvirus特征,但与病毒系统侵染和长距离运输相关的CCC保守结构域被ISC所替代。进化树分析表明该病毒与已报道的Potyvirus亲缘关系较远,其中CP氨基酸进化树分析表明,该病毒与鸭茅线条病毒(Cocksfoot streak virus, CSV)亲缘最较近,CP氨基酸同源性为52.98%;接近全基因组

关键词：马铃薯Y病毒属简并引物长春花脉斑驳病毒茉莉T病毒辣椒环斑病毒辣椒脉斑驳病毒水茄花叶病毒烟草脉带花叶病毒

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