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植物病理学报 2023年第1期53卷 110-118页

作者：盛家伟满益龙欧阳超刘思珍郭盛孙乾隆陈岳张鑫谭新球王运生湖南农业大学植物保护学院长沙410128 湖南大学研究生院隆平分院长沙410125 湖南省农业科学院植物保护研究所长沙410125 湖南省农业科学院农业生物技术研究所长沙410125

由辣椒尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)侵染引起的炭疽病是辣椒生产中最具有破坏性的真菌病害,严重影响辣椒的品质和产量。本研究以辣椒尖孢炭疽病菌HHDL02为对象,采用1 mol·L^(-1)NH_(4)Cl 2%的酶裂解液裂解分生孢子萌发2 h的芽... 详细信息

由辣椒尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)侵染引起的炭疽病是辣椒生产中最具有破坏性的真菌病害,严重影响辣椒的品质和产量。本研究以辣椒尖孢炭疽病菌HHDL02为对象,采用1 mol·L^(-1)NH_(4)Cl 2%的酶裂解液裂解分生孢子萌发2 h的芽管,裂解2~3 h可以高效制备原生质体,结合PEG介导转化法成功将GFP基因导入,其转化菌株菌落形态、菌丝生长速率、分生孢子形态、孢子萌发、附着胞形成、产孢量和致病性与野生型菌株无明显差异,且后代荧光信号遗传稳定。PEG介导的原生质体转化适合辣椒尖孢炭疽菌遗传操作,有助于其致病机理的研究。

关键词：辣椒尖孢炭疽菌 PEG介导转化绿色荧光蛋白芽管

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辣椒胶孢炭疽菌Nis1蛋白的生物学功能研究

辣椒胶孢炭疽菌Nis1蛋白的生物学功能研究

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作者：欧阳超湖南大学

学位级别：硕士

辣椒炭疽病菌是制约辣椒生产的重要真菌,主要侵染辣椒果实和茎叶,影响辣椒的品质和产量。辣椒炭疽病菌种类较多、种群遗传多样性复杂,田间复合侵染频发,抗性品种抗性丧失,导致辣椒炭疽病的防控相对困难。为此,深入解析炭疽病菌与辣椒的... 详细信息

辣椒炭疽病菌是制约辣椒生产的重要真菌,主要侵染辣椒果实和茎叶,影响辣椒的品质和产量。辣椒炭疽病菌种类较多、种群遗传多样性复杂,田间复合侵染频发,抗性品种抗性丧失,导致辣椒炭疽病的防控相对困难。为此,深入解析炭疽病菌与辣椒的互作与识别机制,针对性挖掘靶向性抗性资源,成为辣椒炭疽病有效防控研究热点。前人研究证实保守的真菌效应蛋白Nis1（Necrosis-inducing secreted protein 1）可通过靶向植物免疫激酶抑制病原物相关分子模式触发的免疫（PAMP-triggered Immunity,PTI）,我们前期克隆证实辣椒炭疽病菌NIS1基因存在多态性,但是在辣椒炭疽病菌中的具体功能差异没有相关报道。为此,我们以辣椒胶孢炭疽病菌CSLL11的NIS1为研究对象,探讨对病原菌生长发育和致病性的影响,为辣椒炭疽病的化学防治及抗病育种提供新的靶标和思路。具体研究结果如下:1.克隆了22株辣椒炭疽菌的NIS1基因,成功建立了一种NIS1-PCR-RFLP的标记系统,可快速有效区分侵染辣椒的Colletotrichum truncatum,***,***,***和***,其区分效果明显优于rDNA-ITS标记系统,具有特异性强,简便直观等特点,是炭疽病菌区分新的分子标记。2.成功构建了潮霉素标记的pCX62::ΔCgNis1敲除载体,利用PEG介导的原生质体转化法,敲除了辣椒胶孢炭疽NIS1基因获得突变体菌株47个,PCR验证阳性转化率为65.96%,Southern杂交证实成功敲除了目的基因NIS1。3.成功构建了G418标记的pGTN::ΔCgnis1/CgNIS1回补载体。以突变体菌株ΔCgnis1-3为目标菌株,利用PEG介导的原生质体转化法,获得回补菌株48个,PCR验证回补阳性转化率77.08%,目的基因NIS1回补成功。4.生物学表型分析表明:与野生型比较,突变体ΔCgnis1-3和ΔCgnis1-12菌丝生长速率平均下降8.42%,菌丝极性生长受阻,尖端钝化并伴随畸形生长,产孢量显著降低36.10%,但是分生孢子形态没有变化,对过氧化氢的耐受力下降9.85%;致病力明显低于野生型菌株,细胞质膜完整性受损,而回补菌株相关生物学表型得到恢复,与野生型一致。5.克隆了辣椒胶孢炭疽病菌CSLL11的CgNIS1基因,构建植物亚细胞定位分析载体pBin:CgNIS1:e GFP,利用农杆菌GV3101在本氏烟叶片中进行瞬时表达,结果证实该基因定位在细胞核和细胞质膜,同时发现伴随寄主细胞坏死的现象。6.成功建立了辣椒尖孢炭疽遗传转化体系。采用PEG介导的原生质体转化法成功地将抗性标记基因和e GFP导入尖孢炭疽基因组。结果表明,分生孢子萌发后8～12 hrs和细胞壁裂解时间2 hrs为原生质体最佳制备体系,转化子的潮霉素筛选浓度为400 mg/L,G418筛选浓度为500 mg/L,转化子继代培养3代,荧光显微镜观察荧光信号未发生减弱。

关键词：辣椒胶孢炭疽菌效应蛋白Nis1 生物学功能 PCR-RFLP 辣椒尖孢炭疽菌

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