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“拯救”NA-1株鹅源副黏病毒辅助质粒的构建及鉴定

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中国兽医学报 2008年第5期28卷 515-517,526页

作者：宋子运丁壮徐明马爱霞杜眉常爽毕玉海尹仁福吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

将本实验室保存的NA-1株鹅源副黏病毒(GPMV)经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液进行病毒纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank已收录的ZJ1株GPMV基因组序列,设计了4对特异性引物,利用RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒NP、P和L基因片段,并将目的基... 详细信息

将本实验室保存的NA-1株鹅源副黏病毒(GPMV)经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液进行病毒纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank已收录的ZJ1株GPMV基因组序列,设计了4对特异性引物,利用RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒NP、P和L基因片段,并将目的基因片段消化、回收纯化,克隆pCI-neo表达载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒选取阳性克隆酶切、PCR鉴定并进行序列测定,结果表明NP、P和L基因正确克隆到pCI-neo表达载体中,并分别命名为pCI-NP、pCI-P和pCI-L。将构建好的pCI-NP、pCI-P和pCI-L重组质粒单独转染Vero细胞,在荧光显微镜下观察到特异绿色荧光,表明NP、P和L蛋白得到成功表达。

关键词：鹅源副黏病毒反向遗传操作技术辅助质粒间接免疫荧光

副流感病毒5型CC-14株辅助质粒的构建及鉴定

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中国生物制品学杂志 2016年第6期29卷 588-591页

作者：高菽蔓靳红亮马嫄严妍扈荣良军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122

目的构建副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)CC-14株核衣壳蛋白(nucleoprotein,NP)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和聚合酶蛋白(large protein,L)基因真核表达质粒,并在MDCK细胞中表达,为该病毒反向遗传系统的建立奠定基础。方法根据PIV5 CC-14株全基因组中的NP、P和L基因分别设计特异性引物,经RT-PCR扩增得到NP、P和L基因,酶切后分别连接至pc DNA3.1+真核表达载体(或p MD18-T)上,构建辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L,转染MDCK细胞,RT-PCR检测NP、P和DL基因的转录情况。结果经双酶切及测序鉴定证明辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L构建正确,3个质粒转染MDCK细胞后,经RT-PCR分别可扩增得到NP、P和DL基因片段。结论成功构建了PIV5 CC-14株pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L辅助质粒,且均可在MDCK细胞中有效转录,为该病毒反向遗传系统的建立奠定了基础。

关键词：副流感病毒5型核衣壳蛋白磷蛋白聚合酶蛋白辅助质粒 MDCK细胞

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒pΔGP的构建及转染小肠癌细胞的研究

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武汉大学学报（理学版） 2003年第6期49卷 756-760页

作者：张良李治刘万红刘辉何小华李文鑫武汉大学生命科学学院湖北武汉430072

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,... 详细信息

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI EGFP和pΔGP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白,转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白,而转染有辅助载体pΔGP的HIC细胞不表达绿色荧光.结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功,表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性,并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子.

关键词：辅助质粒共转染启动子绿色荧光蛋白人泡沫病毒小肠癌癌细胞复制缺陷型

“拯救”鹅源副粘病毒NA-1株辅助质粒的构建及鉴定

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“拯救”鹅源副粘病毒NA-1株辅助质粒的构建及鉴定

作者：宋子运吉林大学

学位级别：硕士

本研究将本实验室分离、鉴定并纯化的NA-1株鹅源副粘病毒进行了基因组RNA的提取,以GenBank收录的ZJ1株鹅源NDV全基因组核苷酸序列为模板设计5对特异性引物,通过RT-PCR方法分段扩增了NP、P和L基因核苷酸序列。本研究为“拯救”鹅源副粘... 详细信息

本研究将本实验室分离、鉴定并纯化的NA-1株鹅源副粘病毒进行了基因组RNA的提取,以GenBank收录的ZJ1株鹅源NDV全基因组核苷酸序列为模板设计5对特异性引物,通过RT-PCR方法分段扩增了NP、P和L基因核苷酸序列。本研究为“拯救”鹅源副粘病毒NA-1株而构建的3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L,将其分别转染Vero细胞,经G418筛选后,通过间接免疫荧光试验、SDS-PAGE、Western blot来鉴定构建的3个辅助质粒。构建的辅助质粒为鹅源副粘病毒NA-1株的反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定基础。实验研究表明,副粘病毒V蛋白与毒力强弱有关。本研究模拟副粘病毒“RNA编辑”现象,在2次PCR反应过程中,扩增获得了V基因的全长cDNA。将获得的V基因亚克隆到pCI-neo中,将构建的真核表达质粒pCI-V转染Vero细胞,进行间接免疫荧光试验获得绿色荧光,说明真核表达质粒能够表达V蛋白,表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot试验,用全病毒高免血清进行Western blot检测,出现特异性条带。

关键词：鹅源副粘病毒 NA-1株反向遗传操作病毒拯救辅助质粒

新城疫病毒Italien株辅助质粒的构建和功能鉴定

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新城疫病毒Italien株辅助质粒的构建和功能鉴定

作者：任臻第三军医大学

学位级别：硕士

采用溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)对肿瘤进行治疗的策略是目前肿瘤生物治疗领域的一个新的热点，目前已经有多种天然的以及人工的溶瘤病毒被用于肿瘤治疗研究中，并且通过对天然溶瘤病毒进行基因重组，获得更加安全有效地重组溶瘤病... 详细信息

采用溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)对肿瘤进行治疗的策略是目前肿瘤生物治疗领域的一个新的热点，目前已经有多种天然的以及人工的溶瘤病毒被用于肿瘤治疗研究中，并且通过对天然溶瘤病毒进行基因重组，获得更加安全有效地重组溶瘤病毒是目前研究的一个新方向。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一种天然溶瘤病毒，具有在人体肿瘤细胞中选择性复制的特性，而对人正常细胞没有明显的致病力。通过反向遗传学技术，可以构建携带外源基因的重组病毒。本研究以NDV的强毒株和溶瘤毒株Italien为研究对象，初步探讨了其体外的溶瘤特性，同时构建了基于噬菌体T7启动子的病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)，磷蛋白(phosphoprotein，P)以及L蛋白(large protein，L)的真核表达质粒以及病毒的微型基因组质粒，作为辅助质粒用于今后重组病毒的构建。通过本课题，对NDV Italien株的溶瘤特性有了初步的了解，并且为今后获得重组的新城疫病毒打下了坚实的基础。本研究的主要结果如下：1．检测NDV Italien感染肿瘤细胞后对其杀伤作用利用无特定病原种鸡胚(specific pathogen free，SPF)培养NDV Italien，3天后收集鸡胚尿囊液，浓缩纯化得到病毒悬液。采用TCID50(median tissue culture infective dose)法测定病毒悬液的滴度。NDV Italien感染人宫颈癌细胞HeLa细胞后在不同时间点通过苏木精-伊红染色观察细胞融合情况。用不同剂量的NDV Italien感染肿瘤细胞，测定其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示：NDV Italien经鸡胚培养和超速离心纯化浓缩后，获得了高滴度的NDV病毒悬液，达1010TCID50/ml。苏木精-伊红染色显示，病毒感染肿瘤细胞引起了细胞与细胞之间广泛的融合，最终形成了大量多核细胞即细胞合胞体。MTT细胞毒性实验显示，病毒感染肿瘤细胞后细胞存活率显著下降，表明NDV Italien毒株对肿瘤细胞有很强的细胞杀伤能力。*** Italien株辅助质粒的构建利用RNA提取试剂盒提取病毒的基因组RNA，并且通过高保真的RT-PCR方法获得病毒NP，P和L基因。同时，利用高保真PCR的方法，获得带有T7启动子，内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites，IRES)元件以及EGFP编码序列的片段并连入T载体，得到质粒T7-test。随后，利用酶切的方法将病毒NP，P和L基因分别替换T7-test中的EGFP，得到NP，P和L基因的真核表达质粒。最后，转染上述表达质粒至可以稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞中，利用间接免疫荧光检测细胞中病毒蛋白的表达情况。结果表明：经过鸡胚尿囊腔培养以及病毒纯化后，得到了高浓度的病毒悬液；利用RNA提取试剂盒提取病毒基因组RNA并且进行了RT-PCR，获得了病毒NP、P和L蛋白的编码基因；利用高保真PCR的方法成功得到了携带有T7，IRES以及EGFP的质粒T7-test，将该质粒转染BSR-T7/5细胞后可以观察到EGFP的表达，证实该质粒可以利用T7RNA聚合酶在真核细胞中高效表达下游基因；最后，利用酶切的方法将病毒NP，P和L基因分别替换EGFP，得到了上述基因的真核表达质粒，分别命名为T7-NP，T7-P和T7-L，将上述质粒转染BSR-T7/5细胞后，可以表达病毒蛋白。3．病毒微型基因组质粒的构建以及辅助质粒功能验证合成丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)的自身催化核酶序列(HDVrz)，利用RT-PCR的方法由NDV基因组RNA中扩增3’和5’端的非编码序列，通过overlap PCR的方法将T7启动子，NDV基因组非编码序列，报告基因依次连接，随后通过酶切/连接方式插入包含HDVrz序列质粒得到病毒的微型基因组质粒。利用NDV感染事先转染有微型基因组质粒的BSR-T7/5细胞，通过观察报告基因的表达，验证微型基因组的功能。最后，微型基因组与辅助质粒共转染细胞后通过观察报告基因的表达以了解辅助质粒的功能。结果显示：HDV的自身催化核酶通过人工合成后插入到pUC-57质粒中得到重组质粒pUC-HDVrz，同时在其上游加入酶切位点。利用RT-PCR的方法由病毒基因组RNA中扩增其3’和5’完整的非编码去序列，通过overlap PCR的方法成功地与萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)基因进行连接，并且在片段上游添加了T7启动子序列。将所得到的微型基因组片段通过酶切／连接方法连入pUC-HDVrz中，得到了病毒的微型基因组

关键词：新城疫病毒辅助质粒微型基因组溶瘤病毒

新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定

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中国病原生物学杂志 2014年第6期9卷 500-503,508页

作者：陈兴阎富龙徐一鸣赵权肖朋朋郭海宁靖杰辛舒鲁会军金宁一吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林省兽药饲料监察所吉林长春130062 吉林大学动物医学学院吉林长春130062

目的构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。方法根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因... 详细信息

目的构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。方法根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因,将扩增的NP基因和P基因片段连接到pMD18-T载体上,限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切鉴定确认后回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认pCI-NP、pCI-P辅助质粒的构建。将pCI-NP、pCI-P转染BHK-21细胞,两次换液,72h后回收细胞,经RT-PCR检测NP和P基因片段。结果构建的辅助质粒pCI-NP和pCI-P经双酶切和测序鉴定到目的片段。pCI-NP、pCI-P转染后,RT-PCR检测到NP和P基因片段。结论新城疫病毒pCI-NP、pCI-P辅助质粒构建成功,pCI-NP、pCI-P可在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。

关键词：新城疫病毒 NP基因 P基因辅助质粒鉴定

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新城疫病毒基因Ⅶ型辅助质粒的构建

新城疫病毒基因Ⅶ型辅助质粒的构建

中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：刘云霞仇微红叶贺佳梁昭平

利用反向遗传操作技术,构建新城疫病毒基因ⅧNP、P、L三个辅助质粒,为新城疫病毒基因Ⅶ反向遗传的拯救提供基础。提取尿囊液病毒RNA,利用RT-PCR技术,分别扩增NP、P、L片段,并连接至克隆载体,通过电泳、酶切验证及测序后连接至辅助质粒载... 详细信息

利用反向遗传操作技术,构建新城疫病毒基因ⅧNP、P、L三个辅助质粒,为新城疫病毒基因Ⅶ反向遗传的拯救提供基础。提取尿囊液病毒RNA,利用RT-PCR技术,分别扩增NP、P、L片段,并连接至克隆载体,通过电泳、酶切验证及测序后连接至辅助质粒载体pCI-neo。成功获取NP、P、L三个目的基因,测序结果与预期一致;成功构建pCI-NP、pCI-P、pCI-L三个辅助质粒。本文成功构建的三条辅助质粒为后期NDVⅦ反向遗传的构建提供基础。

关键词：新城疫病毒反向遗传辅助质粒 NP蛋白 P蛋白 L蛋白

来源： cnki会议评论

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新城疫病毒NP、P、L辅助质粒构建及鉴定

新城疫病毒NP、P、L辅助质粒构建及鉴定

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建

第九届全国免疫学学术大会

作者：陈兴阎富龙徐一鸣赵权肖朋朋郭海宁靖杰辛舒鲁会军金宁一吉林农业大学动物科技学院军事医学科学院军事兽医研究所吉林省兽药饲料监察所吉林大学动物医学学院

研究背景:新城疫是可以感染许多禽类的高接触性疫病,目前,该病被OIE列为必须通报的动物疫病,被我国列为一类动物疫病,曾经对我国养禽业造成巨大的经济损失。因为新城疫病毒作为疫苗载体时具有接种途径简单、高滴度、低成本的优势,所以... 详细信息

研究背景:新城疫是可以感染许多禽类的高接触性疫病,目前,该病被OIE列为必须通报的动物疫病,被我国列为一类动物疫病,曾经对我国养禽业造成巨大的经济损失。因为新城疫病毒作为疫苗载体时具有接种途径简单、高滴度、低成本的优势,所以近些年其在疫苗载体方面的研究备受关注。负链RNA病毒反向遗传操作技术是90年代后逐渐兴起的新兴技术,是病毒学研究中重要的工具和平台。目的:反向遗传技术对新城疫病毒的研究也极为广泛深入,但是要启动病毒的复制,则必须由NP蛋白和病毒基因组RNA形成核糖蛋白复合物,P蛋白和L蛋白形成大聚合酶复合物,在细胞中共同表达以启动病毒的复制,所以要拯救新城疫病毒,仅仅病毒的基因组是不够的,所以P蛋白、NP蛋白和L蛋白与NDV全基因组结合形成的核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein complex,RNP)是NDV复制所必需的,所以辅助质粒的构建是必不可少的。方法:本研究根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组序列设计出NP、P、L基因的引物,应用RT-PCR法扩增NP、P、L基因,再分别连接到pMD18-T载体上,经限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切鉴定确认后,回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认后构建成pCI-NP、pCI-P和pCI-L辅助质粒。结果:将pCI-NP、pCI-P和pCI-L分别以5μg和10μg的量转染至BHK-21细胞中,培养72h后回收细胞,经RT-PCR鉴定,结构都出现目的条带。结论:辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L可以在BHK-21细胞中表达,说明新城疫病毒的pCI-NP、pCI-P和pCI-L辅助质粒构建成功,并可以在细胞中表达,从而对该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。

关键词： NDV NP、P、L基因辅助质粒

来源： cnki会议评论

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青岛农业大学学报（自然科学版） 2010年第2期27卷 139-143页

作者：康震扈荣良房丽君张守峰张乐萃青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 军事医学科学院军事兽医研究所吉林大学农学部畜牧兽医学院

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆... 详细信息

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。

关键词：新城疫病毒LaSota株反向遗传操作辅助质粒