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琥珀突变型辅助病毒VCSM13N1的构建

第二军医大学学报 2005年第12期26卷 1340-1342页

作者：高荣凯王琰海军总医院中心实验科北京100037

目的:构建带有琥珀突变的辅助病毒VCSM13N1,为建立选择感染性噬菌体(SIP)技术平台奠定基础。方法:选择辅助病毒VCSM13蛋白ⅢN1区的Q51作为靶位点,采用重叠延伸PCR方法对其进行定点突变,经酶切及序列分析进行确认;噬斑计数法检测该琥珀... 详细信息

目的:构建带有琥珀突变的辅助病毒VCSM13N1,为建立选择感染性噬菌体(SIP)技术平台奠定基础。方法:选择辅助病毒VCSM13蛋白ⅢN1区的Q51作为靶位点,采用重叠延伸PCR方法对其进行定点突变,经酶切及序列分析进行确认;噬斑计数法检测该琥珀突变在允许和非允许菌株中的开、关效应;以HBsAg抗体作为模式体系来确定该突变子作为辅助病毒的可行性,并对其性能进行综合评价。结果:获得了琥珀突变子VCSM13N1,在允许菌株XL1-Blue中其滴度达到2.5×1011,与野生型VCSM13相似(4×1011),而用非许可菌株HB2151进行噬斑计数时,滴度在106水平,降低了数万倍。来源于菌株HB2151的突变病毒感染XL1-Blue计数噬斑,其滴度最高为5×109,降低了50倍;以其在许可菌中制备HBsAg噬菌体抗体,可以得到与野生型相似的结果。结论:琥珀突变子VCSM13N1可以作为辅助病毒,而且在非允许菌株HB2151中有一定的关闭效应。

关键词：突变辅助病毒选择感染性噬菌体

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黄瓜花叶病毒卫星RNA致弱辅助病毒的机理

中国科学（C辑） 1998年第3期28卷 251-256页

作者：梁德林叶寅施定基康良仪田波中国科学院微生物研究所北京100080 中国科学院植物研究所北京100093

分析了卫星RNA致弱的黄瓜花叶病毒 (CMV)侵染的烟草叶绿体内的CP浓度与花叶症状的严重程度成正相关 .用番茄不孕病毒 (TAV)接种表达CMV卫星RNA的转基因烟草叶绿体中 ,TAV CP含量明显比不含卫星RNA的TAV株系侵染的低 ,而在细胞质中TAV C... 详细信息

分析了卫星RNA致弱的黄瓜花叶病毒 (CMV)侵染的烟草叶绿体内的CP浓度与花叶症状的严重程度成正相关 .用番茄不孕病毒 (TAV)接种表达CMV卫星RNA的转基因烟草叶绿体中 ,TAV CP含量明显比不含卫星RNA的TAV株系侵染的低 ,而在细胞质中TAV CP含量无差别 .用完整游离叶绿体进行体外跨膜运输试验 ,CMV CP能快速进入离体叶绿体 ,CP降低叶绿体动力学荧光光谱 .将CMV的CP基因与 1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶小亚基引导肽基因进行体外拼接 .借助农杆菌转化烟草 .转基因烟草表现出黄化、根系发育受抑制 ,产生类似病毒侵染的症状 .

关键词：共瓜花叶病毒卫星RNA 外壳蛋白辅助病毒

转导TNF-α基因的口腔癌DNL中辅助病毒基因的检测

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口腔颌面外科杂志 1997年第3期7卷 174-176页

作者：李涛张志愿何荣根邱蔚六上海第二医科大学口腔医学院颌面外科上海第二医科大学附属瑞金医院口腔科

通过逆转录病毒介导将ＴＮＦ－α基因导入口腔癌ＤＮＬ中，应用ＰＣＲ技术对转导基因ＤＮＬ中ｅｎｖ基因进行了检测。结果转导基因ＤＮＬ中无ｅｎｖ基因存在，证明将外源基因导入ＤＮＬ时无辅助病毒导入。

关键词：口腔癌淋巴结淋巴细胞辅助病毒肿瘤坏死因子

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靶向型辅助腺病毒的构建及其功能研究

中国医药生物技术 2014年第1期9卷 6-12页

作者：杨月峰李泽良鲁茁壮王华肖凤君张群伟孙慧燕王立生军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验血液学研究室北京100850

目的构建一种新型辅助腺病毒,并用于靶向型第三代腺病毒载体的制备,提高其对造血细胞的感染效率。方法采用重叠PCR的方法合成含有不完全包装信号序列A1-A4和loxP序列的DNA片段SynES,替换穿梭质粒pShuttle中原有的包装信号序列,得到穿梭... 详细信息

目的构建一种新型辅助腺病毒,并用于靶向型第三代腺病毒载体的制备,提高其对造血细胞的感染效率。方法采用重叠PCR的方法合成含有不完全包装信号序列A1-A4和loxP序列的DNA片段SynES,替换穿梭质粒pShuttle中原有的包装信号序列,得到穿梭质粒pShuttle-SynES;将所得穿梭质粒与骨架质粒Ad5/F11p在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得重组腺病毒质粒载体pAd5/F11p-HV,将其转染293细胞包装重组腺病毒Ad5/F11p-HV。参照第三代腺病毒包装策略,利用Ad5/F11p-HV包装获得携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;将其以不同的感染强度感染人白血病细胞系K562、U937、Jurkat和人脐带血CD34+细胞后,采用荧光显微镜和流式细胞术检测GFP的表达。结果采用DAN片段SynES替换穿梭质粒pShuttle上的包装信号,获得新的穿梭质粒pShuttle-SynES;进一步构建获得重组腺病毒质粒pAd5/F11p-HV,并制备了辅助腺病毒Ad5/F11p-HV。采用该辅助腺病毒包装pC4HSU-GFP,获得了第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;CsCl密度梯度离心分离HD-Ad5/F11p-GFP和Ad5/F11p-HV,获得了高质量的HD-Ad5/F11p-GFP。与对照病毒HD-H14-GFP相比,HD-Ad5/F11p-GFP可明显提高对人白血病细胞U937、Jurkat和人脐带来源CD34+细胞的感染效率。结论设计并构建了一种靶向性辅助腺病毒,并以此为基础成功制备了对造血细胞高效感染的第三代重组腺病毒。

关键词：辅助病毒白血病第三代腺病毒载体

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轮状病毒反向遗传学研究进展

中华微生物学和免疫学杂志 2019年第7期39卷 544-550页

作者：赵毕妍曾渊君李廷栋葛胜祥厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心361102

反向遗传学技术可直接在基因水平上对病毒的基因组进行操作,从而快速直接的对病毒复制、致病等机制进行详细的研究。目前,呼肠孤病毒科的多种病毒,例如,哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus,... 详细信息

反向遗传学技术可直接在基因水平上对病毒的基因组进行操作,从而快速直接的对病毒复制、致病等机制进行详细的研究。目前,呼肠孤病毒科的多种病毒,例如,哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)等均已利用反向遗传学技术这一有力工具,在病毒各项基础研究中取得了较大进展。但是,对于呼肠孤病毒科轮状病毒属成员,反向遗传学操作系统的构建进展缓慢。自2006年成功建立依赖于辅助病毒的反向遗传学系统开始,直到2017年才成功建立完全只依赖于质粒的反向遗传学系统。本文将对轮状病毒反向遗传学发展过程作一简要综述,并对未来轮状病毒反向遗传学研究方向作一展望,以期为加快轮状病毒的感染机制等基础研究提供技术支撑。

关键词：轮状病毒反向遗传学呼肠孤病毒科感染性克隆辅助病毒

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第三代腺病毒载体的改良与应用

第二军医大学学报 2007年第7期28卷 722-725页

作者：陈琳薛绪潮第二军医大学长海医院普通外科上海200433

腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主细胞染色体等优点,广泛应用于基因治疗。第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处,在其基础上发展了第三代腺病毒载体。第三代腺病毒载体与前者相比,具... 详细信息

腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主细胞染色体等优点,广泛应用于基因治疗。第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处,在其基础上发展了第三代腺病毒载体。第三代腺病毒载体与前者相比,具有低免疫原性及高容量等优点,在基因治疗中表现出独特优势。然而,由于辅助病毒污染的存在及病毒产量有待提高,第三代腺病毒载体的临床应用仍面临一定困难。

关键词：第三代腺病毒遗传载体辅助病毒

一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建

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病毒学报 2006年第4期22卷 267-274页

作者：连忠辉袁振华吴小兵中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 本元正阳基因技术有限公司863计划生物领域病毒基因载体研发基地北京100176

为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2rep基因和AAV5cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插... 详细信息

为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2rep基因和AAV5cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插入cos6粘粒上HSV1基因组片段的UL2基因中,而将EGFP的表达单位插入cos56粘粒上HSV1基因组片段的UL44基因中,用这2个重组粘粒与其它3个粘粒(cos14、cos28、cos48)共转染BHK-21细胞获得了重组病毒HSV1-r2c5-EGFP并进行了空斑纯化。HSV1-r2c5-EGFP病毒能够在BHK-21细胞连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光。用PCR方法以及Southern杂交方法表明所获得的HSV1-r2c5-EGFP中携带有rep2cap5基因,用HSV1-r2c5-EGFP感染携带报告基因LacZ的AAV载体细胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/5-LacZ。结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c5-EGFP可提供AAV2/5载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒。

关键词：单纯疱疹病毒腺相关病毒辅助病毒

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人类C型RNA肿瘤病毒的探索

国外医学参考资料.输血及血液学分册 1978年第1期 14-19页

作者：吴克复

现有的资料已可肯定多种动物的C型RNA肿瘤病毒(oncorna病毒)与它们的白血病和肉瘤有病因学关系。近年来对于人类C型RNA肿瘤病毒(以下简称C型病毒)的探索也有所进展。一、对于C型RNA肿瘤病毒的进一步认识1974年9月在美国国立肿瘤研究所... 详细信息

现有的资料已可肯定多种动物的C型RNA肿瘤病毒(oncorna病毒)与它们的白血病和肉瘤有病因学关系。近年来对于人类C型RNA肿瘤病毒(以下简称C型病毒)的探索也有所进展。一、对于C型RNA肿瘤病毒的进一步认识1974年9月在美国国立肿瘤研究所召开了有关RNA肿瘤病毒的国际讨论会。对其形态、生化、遗传、免疫等方面进行了讨

关键词：辅助病毒白血病病毒肿瘤病毒致癌性病毒逆转录病毒抗原决定簇肉瘤病毒人类 RNA

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第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景

国外医学（病毒学分册） 2005年第5期12卷 146-150页

作者：林芳蔡荣钱程浙江理工大学生命科学院 310018

由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体... 详细信息

由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体,通常称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high-capacity or gutted orhelp-dependent Adenovirus,HD-AdV),现将第三代腺病毒载体的特性研究进展作一综述。

关键词：第三代腺病毒载体辅助病毒 Cre/loxP 腺病毒载体第三代人类基因治疗细胞染色体转基因载体目的基因肠腺病毒辅助病毒特性研究