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高低产鹿茸软骨层RNA-seq分析及花生四烯酸对鹿茸软骨细胞增殖影响的研究

高低产鹿茸软骨层RNA-seq分析及花生四烯酸对鹿茸软骨细胞增殖影...

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作者：邬慧慧华中农业大学

学位级别：硕士

鹿茸作为典型的传统动物药,在我国有着悠久的使用历史。长久以来,在鹿的饲养中,提高鹿茸的产量和质量一直是关注的焦点。鹿茸的生长发育情况是鹿茸产量的主要影响因素,而影响鹿茸生长发育的因素有很多,如遗传、营养、环境等。本研究以... 详细信息

鹿茸作为典型的传统动物药,在我国有着悠久的使用历史。长久以来,在鹿的饲养中,提高鹿茸的产量和质量一直是关注的焦点。鹿茸的生长发育情况是鹿茸产量的主要影响因素,而影响鹿茸生长发育的因素有很多,如遗传、营养、环境等。本研究以梅花鹿鹿茸软骨层组织为研究对象,利用RNA-seq技术对同一饲养条件下,相同年龄的具有显著产量差异的高产和低产梅花鹿鹿茸软骨层组织进行分析,筛选差异表达基因。高产组梅花鹿的花生四烯酸等脂肪酸代谢通路基因表达量显著上调,表明花生四烯酸等脂肪酸对鹿茸的生长具有重要作用,进一步在体外通过CCK8、Edu增殖染色、甲苯胺蓝和阿利新蓝染色、q RT-PCR以及WB等方法探究花生四烯酸对鹿茸软骨细胞的影响。本研究主要结果如下:(1)高低产梅花鹿鹿茸软骨层RNA-seq分析:选取了三头高产(G403、G972、G396)和三头低产(D946、D962、D961)梅花鹿进行无参转录组分析,使用Trinity软件将测序质控后的clean reads组装获得参考序列,共得到194067条Transcript和102023条Unigene,样品的clean reads与组装参考序列平均比对率为86.35%。(2)相较于低产组梅花鹿,高产组共有505个基因上调、278个基因下调;GO和KEGG富集分析发现,高产组的Rap1、Ras、PI3K-Akt、Hippo等增殖相关通路及氨基酸、脂肪酸代谢通路的基因表达量显著上调;选取了增殖相关通路及脂肪酸代谢通路的10个差异表达基因进行q RT-PCR验证,与测序分析结果一致。(3)分离鹿茸软骨层细胞,冻存、复苏培养后,CCK8梯度试验显示,外源添加10μM的花生四烯酸处理24h后,处理组软骨细胞活力极显著升高(P软骨细胞数量明显增多;q RT-PCR结果表明Cyclin D-1基因的表达量极显著升高(P软骨细胞24h以后,阿利新蓝、甲苯胺蓝染色结果显示,处理组软骨细胞分泌的糖胺聚糖的含量明显增加,软骨细胞相关基因COL2α、RUNX2的m RNA表达量显著升高(P软骨细胞,提高了其细胞活力,细胞周期基因的表达量增加,细胞内糖胺聚糖的含量增加,促进了鹿茸软骨细胞的增殖与生长,可以用于进一步探究在梅花鹿养殖中,饲料添加花生四烯酸等不饱和脂肪酸对鹿茸产量和品质的影响。

关键词：鹿茸软骨层产量 RNA-seq 增殖

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