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高氯酸钠和外源性T4对中国林蛙尾吸收和软骨内骨化的影响

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高氯酸钠和外源性T4对中国林蛙尾吸收和软骨内骨化的影响

作者：陈晓燕陕西师范大学

学位级别：硕士

近几十年来,全球范围内两栖动物的生存面临着巨大的威胁,种群数量急剧下降。生物入侵、环境污染、生存环境遭到破坏等是造成两栖类减少的重要原因。其中,一些内分泌干扰化合物已经被证明可以通过干扰两栖动物生命早期阶段体内的激素水平... 详细信息

近几十年来,全球范围内两栖动物的生存面临着巨大的威胁,种群数量急剧下降。生物入侵、环境污染、生存环境遭到破坏等是造成两栖类减少的重要原因。其中,一些内分泌干扰化合物已经被证明可以通过干扰两栖动物生命早期阶段体内的激素水平,进而影响两栖动物的生长发育。高氯酸盐是存在于自然环境中的一类化学污染物,作为钠-碘转运体(NIS)的有效抑制因子,可以减少或组织甲状腺激素的合成,导致两栖动物的发育和生长紊乱。外源性甲状腺素(T4)是一种促进发育的活性物质,可以增加两栖动物体内甲状腺激素水平,进而诱导幼体提前变态。但是,高氯酸钠和外源性T4这些内分泌干扰化合物是否可以通过改变体内甲状腺激素水平来影响两栖动物尾吸收以及骨骼发育,其研究知之甚少。本研究采用中国林蛙(Rana chensinensis)作为研究对象,选取临近变态期(Gs 40期),变态高峰期(Gs 42期)以及变态完成期(Gs 46期)三个时期,通过形态学,组织学以及转录组测序等方法,探讨高氯酸钠和外源性T4暴露对中国林蛙尾吸收分子机制以及软骨内骨化的影响。本研究包括两部分,第一部分探究250μg/L Na Cl O和5μg/L外源性T4暴露对蝌蚪生长发育以及尾吸收过程的影响。将Gs 28期蝌蚪分别置于对照、250μg/L Na Cl O和5μg/L T4溶液中饲养,首先检测不同溶液暴露对Gs 40、Gs 42和Gs 46期蝌蚪的形态学以及变态时间的影响,并通过Masson’s三色法染色检测Gs 40期和Gs 42期蝌蚪尾部的组织学变化。再运用同样的染色方法观察Gs 40、Gs 42和Gs 46期蝌蚪的甲状腺组织结构的改变。此外,通过转录组测序技术对中国林蛙尾吸收相关基因的表达水平进行分析。第二部分探讨250μg/L Na Cl O和5μg/L外源性T4暴露对中国林蛙蝌蚪软骨内骨化过程的影响。通过Masson’s三色法染色对Gs 40、Gs 42和Gs 46期蝌蚪股骨及胫腓骨切片进行染色分析。以及使用阿利新蓝-茜素红双染色法对样本进行染色,以探究不同溶液处理对蝌蚪骨化程度的影响。此外,通过转录组测序技术对中国林蛙软骨内骨化相关基因的表达水平进行分析。研究结果及结论如下:第一部分;1.形态学测量结果分析发现,与对照组相比,250μg/L Na Cl O暴露会延迟蝌蚪发育。而5μg/L T4处理显著降低蝌蚪Gs 40期以及Gs 42期的全长、体长、体重、后肢长以及尾长,并诱发蝌蚪提前变态。表明Na Cl O可抑制中国林蛙蝌蚪的变态,外源性T4可加速中国林蛙幼体的变态过程并减小幼体的体型。2.甲状腺组织学观察结果显示,250μg/L Na Cl O暴露组中国林蛙蝌蚪的甲状腺增大,滤泡增大,甲状腺滤泡上皮细胞厚度增加。5μg/L外源性T4暴露增强了Gs40和Gs 42期中国林蛙蝌蚪甲状腺萎缩,并导致卵泡大小、胶质面积和滤泡上皮细胞厚度减少。表明Na Cl O以及T4暴露会损伤中国林蛙蝌蚪的甲状腺组织学形态。3.尾组织学观察结果显示,在尾吸收过程中,快肌先行消失,且不受Na Cl O暴露的抑制作用。T4暴露会优先诱导肌肉束间结缔组织消失。Na Cl O暴露会延缓尾部脊索的崩塌,而T4暴露会加速尾脊索的皱褶。4.转录组测序结果表明,凋亡相关基因APAF1、BAX和CASP6在T4暴露组中表达水平较高。并且细胞组分降解相关基因MMP9和MMP13的表达在T4暴露下显著上调。此外,细胞中抗氧化酶SOD和CAT在Na Cl O暴露组中的表达更高。因此,外源性T4暴露诱导凋亡相关基因以及细胞组分降解相关基因上调,促进中国林蛙蝌蚪的尾部吸收。而SOD和CAT的高表达可以降低Na Cl O暴露下的ROS水平,从而延缓中国林蛙蝌蚪的尾部吸收。第二部分:1.后肢组织学观察结果显示,250μg/L Na Cl O和5μg/L T4暴露均抑制了股骨及胫腓骨的纵向生长以及骨宽度生长。已有研究证实异常的纵向生长和骨骼发育不良与TH水平的破坏密切相关。此外,一些外源性化合物可通过干扰全身激素调节而对骨强度产生不利影响。因此,250μg/L Na Cl O和5μg/L T4暴露改变幼体体内TH水平而破坏全身稳态,从而抑制蝌蚪后肢生长。2.骨骼双染色结果显示,250μg/L Na Cl O和5μg/L T4暴露均抑制多种骨骼的骨化程度。在250μg/L Na Cl O暴露组中,前臂、髂骨、股骨和胫腓骨的骨化率在Gs 40、Gs 42和Gs 46期中均低于对照组。而在5μg/L T4暴露组中,蝌蚪Gs42期及Gs 40期的全身骨骼完全未骨化。这表明甲状腺激素水平的改变可能会抑制蝌蚪的软骨内骨化过程。3.转录组测序结果表明,T4暴露后,Dio3、TRβ、Runx2、MMP9和MMP13的表达均上调。我们推测过量的THs可能会提高软骨内骨化相关基因的表达水平,对骨发育产生不利影响。综上所述,本实验的结果表明Na Cl O和

关键词：高氯酸钠外源性T4 尾吸收软骨内骨化中国林蛙

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骨关节炎软骨内骨化病理研究进展

中国修复重建外科杂志 2016年第12期30卷 1556-1561页

作者：肖志锋林定坤广州中医药大学第二临床医学院广州510120 广州中医药大学国家重点学科骨伤科实验室广东省中医院骨科

目的综述骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨内骨化的病理表现和机制研究进展。方法查阅有关OA软骨内骨化、骨-软骨重塑及关节发育的相关文献,并进行分析总结。结果软骨细胞的肥大、凋亡,血管的侵入,潮线的复制,软骨钙化层不断增厚和软骨... 详细信息

目的综述骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨内骨化的病理表现和机制研究进展。方法查阅有关OA软骨内骨化、骨-软骨重塑及关节发育的相关文献,并进行分析总结。结果软骨细胞的肥大、凋亡,血管的侵入,潮线的复制,软骨钙化层不断增厚和软骨表层的相对变薄是OA软骨退变的重要特征。关节软骨与生长板在结构上类似,OA的软骨退变是一种类似于生长板的软骨内骨化过程。结论关节软骨失去稳定表征,从静息代谢平衡状态转为临时软骨的高转换状态,继而发生软骨不断钙化和钙化软骨不断骨化重塑,可能是导致OA发生发展的中心环节。

关键词：骨关节炎软骨内骨化生长板软骨细胞肥大骨一软骨重塑

软骨内骨化过程中的血管侵入和软骨细胞的分化

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软骨内骨化过程中的血管侵入和软骨细胞的分化

作者：翟延东武汉体育学院

学位级别：硕士

研究目的:在骨发育和骨折愈合中血管新生和骨形成是相耦合的。尽管人们已早有了解,但具体关系还没有深入的探究。本研究通过检测CD31、Ⅱ型胶原、Fas在软骨内骨化过程中的表达变化,探讨血管侵入和软骨骨化的关系,以及软骨细胞的退变去... 详细信息

研究目的:在骨发育和骨折愈合中血管新生和骨形成是相耦合的。尽管人们已早有了解,但具体关系还没有深入的探究。本研究通过检测CD31、Ⅱ型胶原、Fas在软骨内骨化过程中的表达变化,探讨血管侵入和软骨骨化的关系,以及软骨细胞的退变去向的生物学机制。研究方法:取1到19天内奇数天小鼠双侧股骨,断颈法处死,常规包埋,固定,切片。采用HE染色法观察软骨的形态学变化和血管侵入情况;采用免疫组织化学方法观察CD31、Ⅱ型胶原蛋白、Fas的表达情况;采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测CD31m RNA、Ⅱ型胶原m RNA的表达情况。研究结果:HE染色发现,前5天内血管侵入较少,7到13天血管侵入大量增加,15到19天内,鼠股骨内的软骨基质开始钙化,血管减少。免疫组化染色结果发现:CD31主要在肥大软骨细胞和成骨区内表达;Ⅱ型胶原蛋白主要在软骨增生期和肥大软骨细胞内表达;Fas主要在肥大软骨细胞和成骨区内表达。RT-PCR结果发现:CD31m RNA、Ⅱ型胶原m RNA在1到19天的仔鼠股骨中均有表达。随着骨发育的加快,血管侵入增多,CD31m RNA的表达均随日龄的增加而增加,骨发育进程减缓,CD31m RNA的表达下降。CD31m RNA的表达的峰值出现在第13天。Ⅱ型胶原m RNA的表达的峰值出现在第17天。研究结论： 1)骨骺板生长区和次级骨化中心具有不同的成骨方式,骨次级骨化中心软骨细胞无增生期分化。股骨内骨化过程中,血管侵入与骨发育相互协调,共同促进软骨内骨化;2)在骺软骨板的关节方向,存在一个骨化面,形成并列骨板;3)肥大软骨细胞不是终末细胞,具有内皮表型,并可能转分化为血管内皮细胞,参与血管的构建,促进血管的入侵。

关键词：软骨内骨化 CD31 Ⅱ型胶原 FAS 血管入侵

中国林蛙和中华大蟾蜍跳跃能力的比较以及中国林蛙后肢的软骨内骨化发育机制

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中国林蛙和中华大蟾蜍跳跃能力的比较以及中国林蛙后肢的软骨内骨...

作者：杨红玉陕西师范大学

学位级别：硕士

两栖动物是生物进化中首次出现四肢的动物。四肢的出现有助于两栖动物在陆地上运动,进而适应陆地生活。不同种属两栖动物的运动方式与前后肢长度关系密切:后肢长度相对长于前肢的个体擅长跳跃,而前肢长度长于后肢的个体擅长步行跳跃。... 详细信息

两栖动物是生物进化中首次出现四肢的动物。四肢的出现有助于两栖动物在陆地上运动,进而适应陆地生活。不同种属两栖动物的运动方式与前后肢长度关系密切:后肢长度相对长于前肢的个体擅长跳跃,而前肢长度长于后肢的个体擅长步行跳跃。跳跃是无尾类动物的一种独特运动方式,有助于个体逃避敌害。因此,无尾类动物的生存状况与其跳跃能力的强弱密切相关。然而,关于无尾类动物物种之间跳跃性能比较的研究仍知之甚少。研究发现,跳跃能力依赖于相对后肢长度和相对后肢肌肉重量。此外,后肢-盆骨关节和髂骨-荐椎关节以及荐椎-尾杆骨关节也在跳跃运动中发挥了关键作用。骨骼是四肢结构框架的基础,并为肌肉提供了附着点。附肢骨骼的形成主要通过软骨内骨化过程,并且在时间和空间上受到基因相互作用网络的严格调控。在哺乳动物中,这些基因主要包括以下三大类:以甲状腺激素（THs）为代表的系统因子、以SRY-box包含基因（Sox）为代表的转录因子以及以成纤维生长因子（FGFs）和骨形态发生蛋白（BMPs）为代表的局部分泌因子。本文第一部分比较了中国林蛙（Rana chensinensis）和中华大蟾蜍（Bufo gargarigans）幼蛙（Gs46期）的跳跃能力。首先对两个物种各自的平均最大跳跃距离和形态参数进行了测定。其次通过骨骼双色法比较二者的骨化程度,并通过苏木精-伊红（H＆E）和Masson三色染色法对后肢骨骼切片进行染色观察。第二部分以中国林蛙蝌蚪为研究对象,探究中国林蛙发育过程中跳跃相关结构的变化及其内部分子机制。通过形态学方法测定中国林蛙Gs 40期至Gs 46期发育过程中的形态参数变化。选取Gs 40、Gs 42和Gs 46期的中国林蛙进行骨骼双染色实验,以观察骨骼发育程度。并使用H＆E和Masson染色法检测发育过程中后肢骨骼切片和甲状腺组织切片的变化。此外,通过转录组测序技术对Gs 40、Gs 42和Gs 46期中国林蛙后肢软骨内骨化过程相关基因的表达水平进行了分析。其结果及结论如下:第一部分:中国林蛙的平均最大跳跃距离大于中华大蟾蜍的平均最大跳跃距离,表明中国林蛙的跳跃能力优于中华大蟾蜍。形态学测量结果分析发现中国林蛙的体长、后肢长和体重等形态指标均高于中华大蟾蜍。骨骼双染色法结果表明中国林蛙的骨化程度高于中华大蟾蜍,其中中国林蛙的尾杆骨已与荐后椎发生融合,呈现完整的棒状结构,而中华大蟾蜍的尾杆骨未与荐后椎发生融合。骨骼切片染色结果表明中国林蛙胫腓骨中的皮质骨融合趋势远远超过中华大蟾蜍。这些结构上的差异可能导致中国林蛙和中华大蟾蜍跳跃能力的不同,较高的骨骼结构发育水平有利于个体跳跃能力的增强。第二部分:发育过程中的中国林蛙骨骼长度不断增加,骨化程度不断加深。尾杆骨和胫腓骨皮质骨结构在Gs 46期发育及融合程度最高。甲状腺组织学观察结果显示,甲状腺组织的面积及滤泡上皮细胞高度在发育过程中存在差异,这些差异与骨骼发育中不同的THs需求水平相适应。除此之外,骨化相关差异表达基因的转录分析结果与哺乳动物相似,表明两栖动物软骨内骨化基因的调控方式可能与哺乳动物一致。而骨化相关基因在不同发育时期表达水平的差异表明后肢的软骨内骨化在发育过程中逐渐增强。这些变化可能为中国林蛙的骨骼提供更大的机械强度,增强其运动能力进而为两栖动物在陆地上的运动提供了进一步的保障。综上所述,本研究通过比较中国林蛙和中华大蟾蜍的平均最大跳跃距离,并运用形态学和组织学等方法研究了跳跃能力相关的外部形态特征、内部骨骼结构和基因表达调控水平。结果表明中国林蛙的跳跃能力优于中华大蟾蜍。中国林蛙良好的跳跃能力离不开自身的外部形态特征以及尾杆骨、胫腓骨等结构的完整性,且这种完整性是在发育过程中逐渐完善的。此外,后肢骨骼的发育持续受到软骨内骨化相关基因在分子水平上的表达调控。这些结果有利于帮助我们理解两栖动物跳跃运动的生理机制,也为理解两栖动物的生活及生存能力提供了理论依据。

关键词：跳跃能力中国林蛙中华大蟾蜍后肢软骨内骨化

温度和外源性甲状腺激素对中华大蟾蜍蝌蚪生长发育和软骨内骨化的影响

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温度和外源性甲状腺激素对中华大蟾蜍蝌蚪生长发育和软骨内骨化的...

作者：姚琼陕西师范大学

学位级别：硕士

两栖动物的变态过程受甲状腺激素（THs）精确调控。一些环境胁迫因子（如温度、高氯酸盐和外源性T4）已被证明可干扰甲状腺激素的正常活性,进而影响两栖动物的生长发育。温度是一种非生物因子,可通过改变甲状腺激素水平影响两栖动物的... 详细信息

两栖动物的变态过程受甲状腺激素（THs）精确调控。一些环境胁迫因子（如温度、高氯酸盐和外源性T4）已被证明可干扰甲状腺激素的正常活性,进而影响两栖动物的生长发育。温度是一种非生物因子,可通过改变甲状腺激素水平影响两栖动物的生长发育。一般而言,两栖动物在较高温度下比在较低温度下的生长速率更快、幼体期更短。高氯酸盐是一类化学污染物,可以通过抑制钠碘转运体有效减少或阻止甲状腺激素合成,从而影响两栖动物的生长发育。另外,在水体中的添加外源性甲状腺激素T4可增加蝌蚪体内的甲状腺激素水平,并过早地诱发蝌蚪变态。已有研究表明,上述环境胁迫因子可以通过改变甲状腺激素水平从而影响两栖动物的生长发育。骨骼在身体支撑、器官保护和矿物质的储存中起着至关重要的作用。在两栖动物的生活史中,四肢骨骼的发育能够帮助两栖动物完成从水生环境到陆生环境的转化。大多数骨骼是通过软骨内骨化过程形成的,该过程是由系统因子、转录因子以及局部分泌因子等许多特定分子和软骨细胞分泌的胞外基质（ECM）成分精密调控的。甲状腺激素（THs）属于一种系统因子,可在软骨组织中调控软骨细胞的增殖、肥大以及凋亡。Runt相关转录因子（Runx）调控早晚期成骨细胞和软骨细胞的分化。血管内皮生长因子（VEGF）是一种局部分泌因子,与其受体（VEGFR）结合可以促进血管进入到软骨组织中。而基质金属蛋白酶（MMPs）直接参与胞外基质的重塑。然而,温度、高氯酸盐和外源性T4这些环境胁迫因子是否可以通过改变甲状腺激素水平来影响两栖动物骨骼发育,其报道并不多见。本文以中华大蟾蜍蝌蚪（Bufo gargarizans）为研究对象,探讨温度、高氯酸盐和外源性T4等环境胁迫因子能否通过改变甲状腺激素水平来影响蝌蚪的软骨内骨化过程。本实验内容包括两部分,第一,探讨温度对蝌蚪生长发育以及软骨内骨化过程的影响。将Gs28-Gs46期蝌蚪分别置于15℃、22℃和29℃ 3种水温下饲养,检测温度对Gs40、Gs42和Gs46期蝌蚪的存活、生长发育、变态时间以及骨骼骨化的影响,并通过HE染色检测不同温度下Gs42期蝌蚪甲状腺组织结构的改变。此外,通过RT-qPCR技术检测温度对Gs42期蝌蚪后肢软骨内骨化相关基因表达水平的影响。第二,探讨高氯酸盐和外源性T4对蝌蚪生长发育以及软骨内骨化过程的影响。分别将Gs28期蝌蚪持续暴露在250μg/L NaClO4和10μg/L T4溶液中,至Gs46期。通过形态学测量法分析Gs40、Gs42和Gs46期蝌蚪存活、生长发育以及变态时间情况,并检测Gs42期蝌蚪甲状腺组织特征。通过阿利新兰-茜素红骨骼双染色技术检测250μg/L NaClO4和10μg/L T4对Gs40、Gs42和Gs46期蝌蚪骨化程度的影响。此外,还分析了这两种药物对蝌蚪后肢软骨内骨化相关基因表达水平的影响。研究结果及结论如下:第一部分:1.形态测量显示,与适温相比（22℃）,高温（29℃）显著降低蝌蚪的全长、体长、体重以及后肢长度,并加速了变态。而低温（15℃）显著增加蝌蚪的全长、体长、体重以及后肢长度,并延迟了变态。表明温度可影响中华大蟾蜍蝌蚪的生长发育。2.甲状腺组织病理学检测显示,高温暴露显著减少甲状腺组织中的胶体区域面积,而低温显著增加甲状腺组织中的胶体区域面积。由于甲状腺滤泡中的胶体含量决定着甲状腺激素的分泌能力,表明高温可以增加蝌蚪的甲状腺激素分泌量,而低温降低了甲状腺激素分泌量。3.阿利新兰-茜素红骨骼双染色显示,高温和低温处理均抑制蝌蚪的骨化。蝌蚪后肢骨骼在适温下骨化程度最高,其次是低温,最后是高温。由于已有研究证明甲状腺激素能够影响蝌蚪骨骼发育。表明甲状腺激素水平过度增加或减少均可能会抑制蝌蚪的骨化。4.RT-qPCR结果显示,高温和低温均显著下调软骨内骨化相关基因TRβ、MMP9、MMP13和Runx3基因的表达水平,而显著上调Runx2、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFR-1、VEGFR-2以及VEGFR-3基因的表达水平。结果表明温度可能抑制蝌蚪的软骨内骨化过程。第二部分:5.形态测量显示,250μg/L NaClO4导致蝌蚪的体型增大,并延迟其发育。而10μg/LT4导致蝌蚪的体型减小,诱发其提前变态,并显著降低其存活率。此外,250μg/L NaClO4和10μg/L T4抑制蝌蚪后肢的生长。结果表明高氯酸盐和外源性T4可能会影响蝌蚪的生长发育。6.组织病理学结果显示,250μg/L NaClO4处理显著减少甲状腺组织中的滤泡大小和滤泡上皮细胞高度,并导致滤泡上皮细胞增生。而甲状腺大小、滤泡大小、胶体面积、滤泡上皮细胞高度和滤泡数目在10μg/LT4处理组中是显著减少的。表明高氯酸盐和外源性T4造成了蝌蚪甲状腺组织的损伤。7.骨骼双染色结果显示,250μg/L NaClO4和10μg/L T4抑制蝌蚪的骨化程度。在Gs46期时,对照组蝌蚪后肢骨骼完全骨化,而250μ

关键词：温度高氯酸盐外源性T4 软骨内骨化中华大蟾蜍

miR-145在软骨内骨化中的作用及机制研究

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miR-145在软骨内骨化中的作用及机制研究

作者：龚小珊中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

骨骼的发育主要是通过膜内成骨和软骨内骨化两种方式,其中四肢骨和躯干骨的生长发育主要通过软骨内骨化方式。该过程起始于间充质细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的聚集、增殖,继而分化成软骨细胞,然后软骨细胞增殖、成熟... 详细信息

骨骼的发育主要是通过膜内成骨和软骨内骨化两种方式,其中四肢骨和躯干骨的生长发育主要通过软骨内骨化方式。该过程起始于间充质细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的聚集、增殖,继而分化成软骨细胞,然后软骨细胞增殖、成熟、肥大分化为肥大软骨细胞,再经历凋亡、钙化、血管侵入、破骨细胞和成骨祖细胞产生等过程,接着软骨基质降解,骨小梁形成,最终新的骨组织替代肥大化软骨组织,形成新骨。已经有研究者利用体外重演软骨内骨化的方式构建组织工程骨,有望利用软骨内骨化方式更利于血管化的优点来解决骨修复中面临的早期血供缺乏问题。在软骨内骨化的过程中,软骨细胞肥大化改变及终末分化是关键环节,肥大软骨细胞分泌富含X型胶原蛋白的软骨基质,然后终末分化的肥大软骨细胞分泌多种重要因子,高度协调、综合调控,诱导破骨细胞、成骨细胞、血管的侵入。因此,研究软骨细胞肥大化和终末分化的调控机制,对于调节软骨内骨化过程具有重要价值。越来越多证据显示微小RNA（microRNAs,miRNAs）在软骨内骨化过程中发挥着重要的调控作用。课题组前期研究证实miR-145靶向Sox9调控间充质干细胞成软骨分化,但是miR-145在软骨细胞肥大化过程中是否调控相关基因影响软骨内骨化的进程尚不清楚。本课题旨在探究miR-145在软骨内骨化过程中的作用及对骨修复的效果,并分析其通过靶基因之一TNFRSF11B调控软骨细胞肥大化的机制。材料与方法:1.观察刚出生小鼠的股骨发育过程,利用形态学染色、免疫组化方法确定软骨的静止区、增殖区、肥大区,利用荧光原位杂交实验检测miR-145的分布情况。通过对BMSCs来源的软骨细胞过表达miR-145后,进行肥大化诱导,利用RT-qPCR、Western blot技术检测肥大化相关标志基因,观察miR-145对软骨细胞肥大化的作用;以Balb/c小鼠构建股骨骨折模型,观察miR-145在软骨内骨化过程中发挥的作用。2.结合生物信息学网站和双荧光素酶报告基因检测TNFRSF11B与miR-145的结合关系,利用RT-qPCR、Western blot实验检测TNFRSF11B在肥大化软骨细胞的表达变化情况,并对骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）来源的软骨细胞进行OPG（osteoclastogenesis inhibitory factor）抑制实验,分别从mRNA和蛋白水平检测了肥大相关标志基因的表达。利用RT-qPCR方法检测芒果苷对BMSCs来源的软骨细胞中miR-145的影响。实验结果:1.形态学结果观察到小鼠股骨生长板三层软骨细胞呈柱状排列,体积增大,分为静止区、增殖区、肥大区,在软骨细胞肥大区,Col10a1、CD31表达增加;荧光原位杂交图像显示miR-145在软骨细胞肥大区表达显著强于静止区和增殖区。2.过表达miR-145后,Col10a1、MMP13、Runx2等肥大相关标志基因在mRNA和蛋白水平均高表达于对照组和抑制组,且Osterix、Col1a1、Vegfa的表达也高于对照组和抑制组（p＜0.05）;小鼠骨折模型中,HE、Masson染色和免疫组化显示,过表达miR-145实验组能促进软骨基质降解和骨小梁形成,加快新骨形成。免疫荧光显示Vegfa表达高于对照组。结果说明miR-145通过促进软骨细胞肥大化增强软骨内骨化过程,从而促进骨修复。3.双荧光素酶报告基因显示miR-145显著下调TNFRSF11B的luciferase表达,在肥大化软骨细胞中,TNFRSF11B在mRNA和蛋白水平均显著下降（p＜0.01）;抑制TNFRSF11B表达后,Col10a1、MMP13、Runx2、Vegfa的表达均高于对照组（p＜0.05）,可见低表达TNFRSF11B能够促进肥大软骨细胞的终末分化。在BMSCs来源的软骨细胞中给药MAG后继续肥大诱导,qPCR结果显示给药组的miR-145表达显著高于对照组（p＜0.01）,并且TNFRSF11B的mRNA表达显著低于对照组（p＜0.05）。结论:本课题通过小鼠骨折模型建立了研究软骨内骨化效果和机制的体系,通过体内外实验证明了miR-145能够促进软骨细胞肥大分化,并在软骨内骨化过程中促进软骨基质降解和骨小梁形成,从而促进新骨形成;在机制上,本研究证明了TNFRSF11B是miR-145的靶点基因,过表达miR-145能够抑制TNFRSF11B的表达,提高Col10a1、MMP13、Runx2、Vegfa等肥大化标志基因的表达水平,促进肥大软骨细胞的终末分化。同时,初步证明了芒果苷能够促进BMSCs来源肥大软骨细胞中miR-145的表达,并降低TNFRSF11B的mRNA水平。仍需要通过进一步的实验,明确芒果苷是如何调控miR-145表达以及TNFRSF11B在软骨细胞肥大化过

关键词：软骨内骨化软骨细胞肥大化 miR-145 TNFRSF11B

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氟对中华大蟾蜍后肢软骨内骨化干扰的研究

氟对中华大蟾蜍后肢软骨内骨化干扰的研究

作者：吴超陕西师范大学

学位级别：硕士

氟(fluorine)是一种以多种形态广泛分布于自然界中的元素,它通常是与其他元素结合形成共价化合物,很少以自由离子态分布。在自然界中的水域中,氟的含量通常很低,一般不超过1mg/L。但是由于人为的活动,如合成磷肥、合成色素、半导体和玻... 详细信息

氟(fluorine)是一种以多种形态广泛分布于自然界中的元素,它通常是与其他元素结合形成共价化合物,很少以自由离子态分布。在自然界中的水域中,氟的含量通常很低,一般不超过1mg/L。但是由于人为的活动,如合成磷肥、合成色素、半导体和玻璃等工业产品的制造与应用,导致氟的含量的急剧上升。虽然氟被认为是人和动物健康的一种重要的必要元素,但是高浓度的氟能够对多种组织和器官造成损伤,尤其是骨骼,将可能造成氟骨症(skeletal fluorosis)。骨对于脊椎动物身体的支持、运动、器官保护和矿物质的储存具有至关重要的作用。骨的形成方式有两种:膜内成骨和软骨内骨化。绝大多数的骨是通过软骨内骨化这一方式而形成。软骨内骨化包括三个步骤,分别为软骨细胞的增殖、软骨细胞的肥大和软骨基质的成熟。这个复杂的生物学过程是由一系列分子和胞外成分共同调控。一般认为系统因子,-转录因子以及旁分泌因子共同参与到软骨内骨化的调控中。其中系统因子包括,生长激素(GH)和甲状腺激素(THs);转录因子中有性别决定基因9(Sox9);旁分泌因子包括纤维生长因子(FGFs),骨形态发生蛋白(BMPs),印度豪猪蛋白(Ihh),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和胰岛素样生长因子(IGFs)。一直以来,甲状腺激素被认为是骨骼生长过程中一个重要调节因子。在甲状腺功能低下的儿童中,其长骨生长缓慢,骨的成熟被抑制。甲状腺激素的功能发挥主要是通过其受体α(TRα)介导。在软骨中甲状腺受体α的表达量远高于受体β(TRβ)。作为旁分泌因子,印度豪猪蛋白(Ihh)主要表达于肥大前软骨细胞中,主要参与早期软骨内骨化软骨中一细胞增殖时期。而Sox9主要表达于软骨细胞增殖区,肥大前软骨细胞以及肥大软骨细胞区域。表明其功能是贯穿整个软骨内骨化过程中。目前,骨骼发育中软骨内骨化的相关分子机制的研究主要集中于哺乳动物,对于两栖类骨骼发育中软骨内骨化相关分子机制研究还是很少。因此,研究两栖类骨骼发育中软骨内骨化相关分子机制,以及氟对于两栖类软骨内骨化的影响具有十分重要的理论意义。两栖动物的肢体在胚后发生,其幼体发育环境的水生具有一定可控性的特点。因此,可通过改变不同浓度的离子水暴露处理,探讨氟对软骨内骨化的影响,对于两栖动物生存环境的保护和治理具有一定的应用价值。本研究以中华大蟾蜍幼体为对象,探讨软骨内骨化相关分子机制,以及氟对两栖类软骨内骨化的干扰机制。本研究内容包括两部分,首先,我们运用骨骼双染色方法观测中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)幼体后肢从Gs40到Gs46期的形态发生变化。对幼体不同发育时期后肢进行转录组测序,并分析与软骨内骨化相关基因在Gs40,Gs42和Gs46期的表达谱。接着对转录测序结果进行RT-qPCR验证。最后用原位杂交技术在生长软骨中定位Sox9和Ihh基因表达位置。第二部分,我们将Gs3-Gs46期蝌蚪分别暴露于0、1、5、10和20 mg F-/L的氟离子水中。检测不同浓度氟处理后蝌蚪肢在G40到G46的发育变化。用对照和10 mg F-/L组Gs40,Gs42和Gs46期蝌蚪后肢进行转录组测序,分析软骨内骨化相关基因的差异表达谱,RT-qPCR验证。原位杂交定位Sox9和Ihh在生长软骨中的表达。实验的主要结果和结论如下:1、骨骼双染色显示,在中华大蟾蜍变态过程中其后肢骨化逐渐增强以及后肢的骨化次序是由近端到远端。例如,股骨、胫腓骨和跖骨在Gs40期开始骨化,并在G42期骨化完全。此外整个后肢骨骼系统在Gs46期骨化完全。表明中华大蟾蜍后肢的软骨内骨化是在蝌蚪变态过程进行,后肢可作为研究软骨内骨化的动物模型。2、转录组测序结果显示,在后肢cDNA文库中总共有31个与软骨内骨化相关的基因,并分析了在变态过程中他们的表达图谱。同时Sox9,Ihh,FGF3,Wnt1Ob,D2,D3,TRα,TRβ基因进行RT-qPCR验证,结果与转录组数据基本一致。证明本实验的转录组数据是可靠的。3、原位杂交定位显示,Sox9mRNA主要表达于后肢的软骨细胞增殖区,肥大前软骨细胞以及肥大软骨细胞区域;而Ihh主要表达于肥大前软骨细胞区域。表明Sox9的功能贯穿整个软骨内骨化过程,而Ihh的功能主要在细胞增殖时期。4、氟暴露后的骨骼双染色显示,10 mg F-/L能够抑制蟾蜍幼体后肢的软骨内骨化。在G40期,对照组蟾蜍幼体后肢的腓附骨和胫骨已经开始骨化,而100 mg F/L处理组的腓附骨和胫骨的骨化还未开始。这表明氟暴露将抑制幼体后肢软骨内骨化。5、转录测序结果显示,10mgF-/L处理下调了Ihh,Sox9,D2,D3,TRα,TRβ,Wnt10b,FGF3和BMP6在蟾蜍幼体后肢的mRNA表达,但是上调了ObRb和HHAT mRNA表达。这些基因的RT-qPCR表达变化与转录测序结果基本一致。表明氟能够影响软骨内骨化相关的基因,从而会抑制后肢的软骨内骨化。6、原

关键词：软骨内骨化后肢中华大蟾蜍氟

表皮生长因子受体对小鼠初级软骨内骨化、破骨细胞的募集及生成的影响

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吉林大学学报（医学版） 2007年第3期33卷 494-498页

作者：王珂李然伟王秀岩杨世杰吉林大学第二医院呼吸内科吉林长春130041 吉林大学第二医院泌尿外科吉林长春130041 吉林大学基础医学院药理学教研室吉林长春130021

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)信号转导在软骨内骨化中的作用。方法:以EGFR敲除鼠(EGFR-/-)、EGFR正常野生鼠(EGFR+/+)和(或)杂合子鼠(EGFR+/-)为实验动物模型,通过马森三色染色(Trichrome Masson)、原位杂交及抗九石酸酸性磷酸酶(TR... 详细信息

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)信号转导在软骨内骨化中的作用。方法:以EGFR敲除鼠(EGFR-/-)、EGFR正常野生鼠(EGFR+/+)和(或)杂合子鼠(EGFR+/-)为实验动物模型,通过马森三色染色(Trichrome Masson)、原位杂交及抗九石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察各组小鼠四肢长骨软骨内骨化及破骨细胞募集情况的变化;体外分离培养破骨细胞,加入EGFR酪氨酸激酶的抑制因子AG1478,通过对破骨细胞生成实验的观察,明确EGFR信号转导在破骨细胞中的作用。结果:EGFR+/+鼠与EGFR+/-鼠有相同的表型,因此在实验中将它们皆看做EGFR+/+鼠。形态学观察EGFR-/-鼠肥大细胞区域较EGFR+/+鼠增大,其区域大小约为EGFR+/+鼠的5倍;EGFR-/-鼠破骨细胞向中心生长板的募集速度较EGFR+/+鼠亦明显延迟;在胚胎16.5 d(E16.5)dEGFR-/-和EGFR+/+鼠金属蛋白酶-9(MMP-9)分布上有一定差别,但单个破骨细胞上MMP-9的表达数量二者无明显差别;加入EGFR抑制因子AG1478的实验组与加入DMSO的对照组比较,破骨细胞的形成明显减少(P软骨内骨化的进展。

关键词：受体,表皮生长因子骨发育软骨内骨化破骨细胞生成

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力学激励对长骨软骨内骨化的影响

力学激励对长骨软骨内骨化的影响

作者：刘秀丽哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

力学环境能够影响骨形态已经成为了骨生理学的基本准则。目前,国内用实验的方法,考虑生物因子对骨生长的影响的研究比较成熟。但是由于人体是一台复杂的机器,骨骼是一种特殊的材料,再加上复杂的生命运动形式使得实验研究受到很大限制。... 详细信息

力学环境能够影响骨形态已经成为了骨生理学的基本准则。目前,国内用实验的方法,考虑生物因子对骨生长的影响的研究比较成熟。但是由于人体是一台复杂的机器,骨骼是一种特殊的材料,再加上复杂的生命运动形式使得实验研究受到很大限制。在国内尤其是从生物力学角度出发,运用有限元方法考虑生物力学因素对从胎儿期开始的骨生长过程影响的研究还未见报道。本课题研究的目的是采用ANSYS有限元方法模拟骨结构和骨生长过程,并分析不同生物力学因素对骨生长过程的影响,为更好地解决由于不同力学环境造成的骨疾病提供一定的理论依据和参考依据。本文从生物力学的角度出发,以骨生长和骨再造理论为基础,结合骨生长生理机理,选择第二掌骨远端为长骨模型的研究对象,运用ANSYS方法建立三维有限元模型,进行力学激励对软骨内骨化和生长影响的分析。本文主要研究内容包括以下几个方面: (1)模型选取与建立。选择第二掌骨远端作为长骨研究对象,运用ANSYS方法建立其三维有限元模型。 (2)骨生长过程模拟。利用每日生骨指标构造反映时间积累效应的成熟指标判断是否骨化,结合最优骨密度公式进行骨再造模拟,由此模拟软骨在不同时间段的骨化和再造情况。 (3)模拟结果分析。分析讨论不同载荷大小和生物力学参数条件下的骨生长过程。验证力学激励对骨生长过程的影响,并给出适合骨生长的最优载荷条件和生物力学参数。本文的创新之处是结合力学激励及加载历程,引入应变能密度的骨生长算法,通过运用ANSYS有限元法模拟了骨生长过程,得到的过程与利用Carter的理论得到的结果一致,也是符合生理过程的,验证了其合理性。本文以骨生长理论与骨再造理论为基础,模拟出骨生长过程,并验证带有时间历程的单位应变能密度作力学激励的骨生长算法的合理性。为定量的从生物力学角度进一步研究骨生长和理解由于不同生物力学环境及条件造成的骨疾病提供了一定的参考价值,丰富了骨生长理论。

关键词：软骨内骨化长骨骨生长力学激励有限元法