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生物工程学报 2018年第6期34卷 916-927页

作者：李阳吴非蔡冬波占杨杨李俊辉陈晓斌陈慧超陈守文马昕湖北大学生命科学学院生物资源绿色转化湖北省协同创新中心湖北省环境微生物工程技术研究中心湖北武汉430062 绿康生化股份有限公司福建浦城353400

杆菌肽是微生物产生的由11种氨基酸残基组成的广谱性抗生素,前体物的供应可能是限制杆菌肽高产的重要因素。文中通过支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)的添加实验考察了前体物质支链氨基酸对杆菌肽高产的影响,证实了异亮氨酸(Ile)... 详细信息

杆菌肽是微生物产生的由11种氨基酸残基组成的广谱性抗生素,前体物的供应可能是限制杆菌肽高产的重要因素。文中通过支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)的添加实验考察了前体物质支链氨基酸对杆菌肽高产的影响,证实了异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的添加可以提高杆菌肽的效价,其中Ile的添加对杆菌肽效价提高的效果较为明显。随后,文中以地衣芽胞杆菌DW2为出发菌株,分别构建了支链氨基酸转运蛋白Yhd G的缺失和强化表达菌株。发酵结果表明,转运蛋白Yhd G缺失工程菌DW2△yhd G的杆菌肽效价达到917.35 U/m L,与原始菌DW2相比提高了11%,而强化Yhd G则会使杆菌肽效价下降25%。最后通过分析胞内胞外支链氨基酸含量,发现缺失转运蛋白Yhd G能够在发酵中后期显著提高胞内支链氨基酸含量,表明氨基酸转运蛋白Yhd G在地衣芽胞杆菌DW2中可能发挥着氨基酸输出的功能。综上,文中通过缺失转运蛋白Yhd G显著提高了地衣芽胞杆菌胞内支链氨基酸的供给水平,从而提高了杆菌肽效价,为杆菌肽高产菌株的构建提供了一种新的策略。

关键词：杆菌肽地衣芽胞杆菌支链氨基酸转运蛋白yhdg

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通过改造地衣芽胞杆菌支链氨基酸合成和转运途径提高杆菌肽产量

通过改造地衣芽胞杆菌支链氨基酸合成和转运途径提高杆菌肽产量

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作者：李阳湖北大学

学位级别：硕士

杆菌肽是一种由12个氨基酸残基组成的多肽类抗菌肽,主要由枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌通过非核糖体多肽合成酶合成。杆菌肽可以抑制革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性菌细胞壁的合成,常被用于饲料添加剂。前体物的供应可能是限制杆菌肽高... 详细信息

杆菌肽是一种由12个氨基酸残基组成的多肽类抗菌肽,主要由枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌通过非核糖体多肽合成酶合成。杆菌肽可以抑制革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性菌细胞壁的合成,常被用于饲料添加剂。前体物的供应可能是限制杆菌肽高产的重要因素,前期研究发现提高异亮氨酸和缬氨酸的供给可以提高杆菌肽的产量,其中异亮氨酸的效果比较显著。本研究利用基因工程的方法,强化了支链氨基酸的合成途径、削弱了支链氨基酸的旁路途径和改造了支链氨基酸的转运途径,进而提高胞内支链氨基酸的含量,发现过表达支链氨基酸氨基酸合成途径关键酶乙酰羟酸合酶基因ilvB和缺失支链氨基酸转运蛋白yhdg可以提高杆菌肽的产量。最后,我们通过在ilvB过表达工程菌中缺失转运蛋白yhdg,进而成功获得杆菌肽高产菌株。本研究通过KEGG和NCBI数据库,发现在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中异亮氨酸的合成过程中有4个关键酶,分别是天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶,其中乙酰羟酸合酶是支链氨基酸合成的共有关键酶;支链氨基酸旁路途径甲硫氨酸合成的关键基因为metA,编码高丝氨酸琥珀酰基转移酶的合成;枯草芽胞杆菌中支链氨基酸转运蛋白主要有BmFE、BrnQ和yhdg(BcaP)等,其中yhdg是最有效的支链氨基酸转运蛋白。我们通过基因工程的方法,对支链氨基酸合成途径的五个基因进行了强化表达,同时构建甲硫氨酸关键基因metA和转运蛋白基因yhdg的缺失工程菌。其中,支链氨基酸合成基因中乙酰羟酸合酶基因ilvB游离型过表达工程菌相的杆菌肽产量比原始菌DW2提高了 11.01%,为了消除游离质粒的影响,将ilvB整合到DW2基因组中整合型过表达,其杆菌肽产量相比DW2提高了 14.06%;而转运蛋白yhdg缺失工程菌的杆菌肽效价达到917.35 U/mL,比DW2提高了 11.21%。最终,我们在ilvB整合型过表达工程菌中缺失了转运蛋白基因yhdg的工程菌,其杆菌肽效价达到995.25 U/mL,比原始菌DW2提高了 21.11%。为了研究乙酰羟酸合酶基因ilvB过表达对菌株代谢的影响,我们检测了杆菌肽发酵过程中胞内外支链氨基酸、赖氨酸和甲硫氨酸的氨基酸变化,发现支链氨基酸的含量在杆菌肽合成期显著提高,而赖氨酸和甲硫氨酸基本与原始菌一样。同时,我们也研究了转运蛋白yhdg对杆菌肽产量的影响,我们通过过表达和缺失基因yhdg,并检测了检测他们的相对转录量,发现yhdg的转录量越高,杆菌肽产量越低。然后我们进一步检测了yhd 缺失工程菌中支链氨基酸的变化情况,发现地衣芽胞杆菌DW2中yhdg的功能为外排支链氨基酸,这与枯草芽胞杆菌中报道的功能相反。此外,我们通过检测其他常见的17种氨基酸,证明yhdg并不是支链氨基酸的特异性转运蛋白。本研究成功构建了杆菌肽高产菌株DW2::ilvB△yhdg,并通过将培养基氮源豆粕浓度从10%优化到8%,将杆菌肽效价提高到1060.03U/mL,同时也降低了原料成本,为杆菌肽的工业化生产奠定了基础。

关键词：杆菌肽地衣芽胞杆菌支链氨基酸转运蛋白yhdg 乙酰羟酸合酶IlvB

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