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新型N-糖链受体的合成及其应用

新型N-糖链受体的合成及其应用

作者：汪素芳延边大学

学位级别：硕士

近年来,人们研究发现N-连接糖链与细胞癌症的发生和转移以及造血功能损伤有密切关联,因此对于N-连接糖链的结构与生物功能方面的研究日趋引起学者们的关注。但是,由于糖分子本身不含有π-π共轭结构,因而不能对其进行紫外或者荧光检测;... 详细信息

近年来,人们研究发现N-连接糖链与细胞癌症的发生和转移以及造血功能损伤有密切关联,因此对于N-连接糖链的结构与生物功能方面的研究日趋引起学者们的关注。但是,由于糖分子本身不含有π-π共轭结构,因而不能对其进行紫外或者荧光检测;同时由于已经开发出来的寡糖衍生化试剂总是存在衍生反应难控制或者质谱检测灵敏度低等问题,不能满足当前糖生物学分析的需要。因此,开发具有质谱响应灵敏性高的新型衍生化试剂及探索其应用于糖蛋白中N-糖链的检测有着重要意义。本论文重点研究了五种含有Boc-Asn-GlcNAc单元的新型受体对含有N-糖链的糖类物质进行分析,合成的受体具有紫外吸收,水溶性好,带有正电荷易于离子化的特点,能够有效的提高其糖链转移率,并具有较高的质谱响应;并对受体与N-糖链的反应条件和质谱检测条件进行了优化,对检测方法进行了考察。本论文主要做了以下研究：1.合成了四种用于检测N-连接糖链的受体,优化了各受体的合成条件以及纯化方法,并对目标化合物进行了核磁、质谱、紫外、熔点等表征。2.由于内切酶Endo-M可以作用于糖肽内侧的GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键,使复杂的糖肽转变成寡糖,我们利用所合成的受体对寡糖链进行修饰,进而实现对样品中寡糖的分析及检测。本文初步探讨了在Endo-M作用下五种受体对唾液酸糖肽中的寡糖的检测,由于所合成的受体易离子化或已带电荷,所以可以很大程度地提高糖链衍生物在质谱检测器上的检测灵敏度。3.合成受体过程中的中间产物MDPZ, TFPZ可以作为衍生化试剂应用于检测羧酸类物质,摸索了衍生化方法,并建立了一种简便、快速的MS检测方法。

关键词： N-糖链内切酶Endo-M 转糖基衍生化试剂

222残基对Tn0602合成低聚半乳糖的影响

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222残基对Tn0602合成低聚半乳糖的影响

作者：张健吉林大学

学位级别：硕士

低聚半乳糖(Galactooligosaccharide,GOS)作为一种功能性益生元,可以以食品补充剂的形式掺入到各种产品中,以增强人体内多种与健康相关的生理活动。目前,低聚半乳糖的最常用的制备方法是利用β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶促合成方... 详细信息

低聚半乳糖(Galactooligosaccharide,GOS)作为一种功能性益生元,可以以食品补充剂的形式掺入到各种产品中,以增强人体内多种与健康相关的生理活动。目前,低聚半乳糖的最常用的制备方法是利用β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶促合成方法。然而,由β-半乳糖苷酶催化合成的GOS,其内部具有多种糖苷键及聚合度,难以分离纯化。根据前期研究基础,我们发现来自Thermotoga naphthophila RUK10的β-葡萄糖苷酶可以特异性催化GOS3的合成。为了探索其合成机制,我们选择了位于活性口袋的一些位点进行突变,其中N222Y/F突变体的水解活力和转糖苷活力明显降低,表明该位点可能是酶催化的关键残基。同时,利用同源建模获得Tn0602的三维结构,并与底物进行分子对接,分析酶与底物之间的相互作用,确认了N222位于糖苷配基+1亚位,与活性位点E166和E351空间上靠近,再次说明可能是催化活性的关键残基。因此,选择N222位点进行饱和突变,成功构建并表达了饱和突变体。使用Ni-NTA亲和层析方法分离并纯化饱和突变体,并利用纯化酶对酶的水解活力和转糖苷活性进行表征。在野生型酶水解乳糖的最适p H条件下,所有突变体的活力均不同程度地降低。其中,与Asn具有相似侧链结构的相应氨基酸突变体(如Ser、Gln等)其活力与野生型相似;而突变为具有最小侧链的Gly、具有较大侧链的Leu和Ile、碱性氨基酸Arg和Lys,以及芳香族Phe和Tyr的对应突变体,其水解乳糖的活力降低最明显。然而,N222S突变体尽管在p H 5.0条件下,活性稍有降低,但处于p H 3.0条件中,水解乳糖活力可提高约20%。相较于野生型酶,突变体在水解乳糖的反应中,最适反应温度和最适p H存在少许偏移,并且其动力学常数表明突变体对底物的专一性降低。以上结果表明,对N222位点的突变都会导致酶水解乳糖活力的不同程度地降低,说明222位点的天冬酰胺残基是与该酶水解活性相关的关键性氨基酸残基之一,也是自然选择的最优结果。在GOS3的催化合成中,可提高合成产量的突变体包括N222W、N222D、N222Q,产率相较于野生型分别提高了23%、36%、6%。同时,突变体N222W可提高催化合成GOS4的产率,较野生酶型提高了44%。以上结果说明222位点的有些突变体可以增强酶的转糖基活力,尽管另一部分突变体未呈现增强转糖基的效果,但由于其乳糖水解活性的大幅度降低,也可以增强GOS3的时间效应积累。虽然GOS3的最高产量没有提升,但是却能够将其维持在相对较高的水平,如突变体N222G催化合成GOS3的趋势是持续增加的,在24 h时可达到野生型最高产物量的85%,在84 h时达到110%左右;突变体N222E催化合成GOS3的最大产量只比野生型低5%,8-12 h的产量可维持在较高水平,随着反应的进行,产率虽然有轻微降低,但是也可将产率维持在最大值的80%左右。以上结果说明,相较于野生型酶,部分突变体更加适合于工业生产低聚半乳糖。222位点的饱和突变不仅获得了可以提高GOS产量的突变体,同时也证明了通过合理化设计,降低酶的水解活力,同时提高转移酶/水合酶的比例是提高其应用性能的有效途径。在后续研究中,可以对具有优异性质的突变体进行叠加,以探究位点的协同作用对GOS催化合成的影响,并进一步提高突变体的应用性能。

关键词： β-葡萄糖苷酶饱和突变低聚半乳糖转糖基乳糖水解

两种新型甘露聚糖水解酶的生化特征、分子改造与催化特性的研究

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两种新型甘露聚糖水解酶的生化特征、分子改造与催化特性的研究

作者：宓延红山东大学

学位级别：硕士

甘露聚糖是一类具有复杂结构的植物多糖,其主链通常是由甘露糖、葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的。根据其分支结构的糖单元组成特征,可分为纯甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘聚糖。甘露聚糖具有独特的理化性质,如可... 详细信息

甘露聚糖是一类具有复杂结构的植物多糖,其主链通常是由甘露糖、葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的。根据其分支结构的糖单元组成特征,可分为纯甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘聚糖。甘露聚糖具有独特的理化性质,如可吸水成胶、具有一定化学惰性强且生物安全性高,因而广泛应用于食品、制药和纺织工业中。与多糖不同,甘露寡糖具有重要生理活性,如抗肿瘤、调节免疫力、促进细胞分裂等。研究还表明,甘露寡糖的生物活性与糖单元的组成、聚合度的大小等密切相关。甘露聚糖酶是一类糖基水解酶(Glycoside Hydrolases,GHs)的总称,能催化多糖内不同类型糖苷键的降解,从而生成分子量更小的寡糖。相比化学或物理方法,酶法降解甘露聚糖制备寡糖的策略具有因反应条件温和而可控性强、因底物选择性清晰而产物明确等优势。然而,目前市场少见能够制备具有特定结构寡糖片段的工具型β-甘露聚糖酶。因此,深入进行相关的酶学资源开发、分子改造及催化特性的研究成为重要的前期基础。甘露聚糖因结构复杂而需要多种酶,如内切酶、外切酶或糖苷酶的协同作用才能实现较为彻底的降解。其中,内切型β-甘露聚糖酶(EC 3.***.1.78)可随机切割甘露聚糖主链内部的β-1,4糖苷键,是目前关于甘露聚糖酶的研究热点,主要集中在β-甘露聚糖酶的资源开发、晶体结构以及通过分子改造来改变酶的生化特征的研究。然而,关于β-甘露聚糖酶的底物选择性、多糖底物降解模式、寡糖生成特性,及其与催化机制的关联研究则相对较少,这限制了 β-甘露聚糖酶在如寡糖定向制备、糖链测序等方面的精确应用。海洋来源的火色杆菌属(Flammeovirga sβ.)MY04菌株,能以包括甘露聚糖、琼脂糖、褐藻胶等在内的十余种多糖为唯一碳源进行生长,因此也是一株甘露聚糖酶的资源菌。本文首先对MY04菌株的全基因组进行分子挖掘,获得了两个潜在β-甘露聚糖酶基因man01929和man02066;借助生物信息学的软件分析了Man01929和Man02066的蛋白质序列特征;分别构建表达载体、异源表达并纯化了重组酶,重点比较分析了 β-甘露聚糖酶rMan01929和rMan02066在生化特征、底物选择性、底物(多糖和寡糖)降解模式、产物(寡糖)生成特性等诸多方面的差异,分析了相关的内在联系。本文基于β-甘露聚糖酶Man01929的三维结构模拟,进行了理性设计与定点突变,并通过比较研究,分析了酶的底物选择性、寡糖产物生成特性与蛋白质结构之间的内在关系,探讨了 Man01929及其系列突变体之间可进行不同催化机制类型转变的分子机制。本文主要研究结果如下:1、β-甘露聚糖酶Man01929和Man02066的序列特征、生化特征与酶学特性的比较研究(1)β-甘露聚糖酶Man01929和Man02066的序列特征β-甘露聚糖酶Man01929含有932个氨基酸,理论分子量为103.1kDa,等电点为4.25,且无信号肽。预测Man01929有五个功能模块,N端含一个GH5催化模块,447-585 位氨基酸残基为 Coagulation factor 5/8 C-terminal 模块、595-766位氨基酸含有 2 个 PKD/Chitinase 模块、C 端含有 Carbohydrate-binding module 64(CBM64)和 Secretion system C-terminal sorting domain 两个功能模块。在已鉴定的酶中,Man01929 与来自 Blue Mussel Mytilus edulis的Man5A 的一致性最大,36.79%。系统发育树分析表明Man01929属于GH5家族中10亚家族。β-甘露聚糖酶Man02066含有378个氨基酸,理论分子量为44.1kDa,等电点为5.49,N端1-22位氨基酸残基为Ⅰ型信号肽。Man02066仅含有一个GH26催化模块(Glycoside hydrolase family 26 domain)。在已鉴定的β-甘露聚糖酶中与来自Cellvibrio japonicus的CjMan26C序列一致性最高,为42.82%,系统发育树分析表明Mna02066属于GH26家族。(2)重组酶rMan01929和rMan02066的生化特征重组酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(KGM)和槐豆胶(LBG)的最适温度分别是40℃C和50℃,最适pH分别是8.0和5.0;重组酶rMan01929具有一定的热稳定性(0-40℃)和较宽的pH耐受性(5.0-10.0);金属离子Co2+加入不同底物的反应液中,对rMan01929的活性有不同的影响,如当底物为KGM时可以促进rMan01929的活性,当底物为LBG是,显著抑制rMan01929的活性。重组酶rMan020

关键词：火色杆菌 β-甘露聚糖酶底物降解模式寡糖生成特性定点突变转糖基

嗜热糖苷酶的改造及GOS3对LS174T细胞的活性

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嗜热糖苷酶的改造及GOS3对LS174T细胞的活性

作者：衣丽吉林大学

学位级别：硕士

功能性低聚半乳糖(Galacto-Oligosaccharides,GOS)是一种益生元,不能被人体利用,不会在小肠被消化,从而能够顺利到达结肠,被结肠中的微生物发酵,刺激结肠内有益菌群生长。GOS也通过影响肠道上皮杯状细胞直接支持肠道屏障功能,GOS通过刺... 详细信息

功能性低聚半乳糖(Galacto-Oligosaccharides,GOS)是一种益生元,不能被人体利用,不会在小肠被消化,从而能够顺利到达结肠,被结肠中的微生物发酵,刺激结肠内有益菌群生长。GOS也通过影响肠道上皮杯状细胞直接支持肠道屏障功能,GOS通过刺激杯状细胞产生更多的黏液,并调节降低黏液层渗透性基因表达,增强肠道屏障功能,从而减少结直肠癌症(Colorectal Cancer,CRC)的发生。尽管GOS的工业生产主要利用β-半乳糖苷酶,但该酶催化合成的GOS都为多种聚合度(Degree of polymerization,DP)的混合物,很难纯化,而聚合度不同的GOS益生功能也不同。课题组前期的研究表明,来自Thermotoga naphthophila RUK10的β-葡萄糖苷酶Tn0602,与β-半乳糖苷酶相比,催化转糖苷反应合成的GOS只有β-(1,3)糖苷键和β-(1,4)糖苷键,且绝大部分为GOS3,只有极少量GOS4,更单一的DP与更少种类的糖苷键,可以降低产物纯化与分离的难度和成本。由于水解活性是糖苷酶的主要活性,因此,通过合理设计改造Tn0602以期获得更优异的突变体具有重要研究和应用价值。同时,探索单一DP的GOS3对杯状细胞LS174T的影响也有助于其进一步的应用。分析β-葡萄糖苷酶与β-乳糖分子3D对接结果,N222位点位于活性位点E166的周围,可能会影响酶的活性位点与底物乳糖形成的氢键,影响酶与底物的亲和力;N222位点还与N246位点十分接近,也可能形成氢键影响酶蛋白与底物的结合方式。W383与F414位点在底物结合位点的周围,其氨基酸残基的改变可能会与周围残基相互影响,改变酶活性中心口袋的大小,以及酶与底物的亲和力等。本论文选择N222、W383和F414位点中已经验证过的有较好结果的突变体,相互组合进行叠加突变,成功获得了11个叠加突变体,使用Ni-NTA亲和层析对叠加突变表达的目的蛋白进行纯化,进行一系列关于酶水解活力和转糖苷活力的表征,希望能获得水解活力与转糖苷活力提高的突变体。结果表明,与Tn0602相比,叠加突变体W383F-N222A在p H 7.0的PB缓冲液中水解乳糖的活力提升了76%,其余突变体水解乳糖活力都有着不同程度的降低,其中突变体F414Y-N222A和F414Y-N222Q的水解活力约为Tn0602的71%和74%,其余突变体的水解活力则下降比较明显。相较于Tn0602,以乳糖为底物时的水解反应,部分突变体水解最适温度和最适p H会略微偏移,动力学常数表明突变体酶与底物的亲和力降低了。在转糖苷催化合成GOS的反应中,F414Y-N222Q与F414Y-N222A比Tn0602表现更优异,GOS3产率都有提高,其中,F414Y-N222A合成GOS4的效率有所提高,其他叠加突变体的转糖苷活力都低于Tn0602。使用F414Y-N222A大批量合成GOS3,纯化后作用于杯状细胞LS174T,与商用多DP的GOS对比,初步分析了单一DP的GOS3对细胞的影响。q PCR结果分析得出,在GOS3浓度为8 mg/m L时,MUC2的表达量提升了2.3倍,TFF3的表达量更是提升至6.5倍,商用GOS在浓度为12 mg/m L时,MUC2的表达量提升了1.6-1.7倍,TFF3的表达量被抑制,为对照组的73%。结果表明,GOS3对黏液基因的调控效果明显优于商用GOS,尤其是对TFF3基因的调控。可见,GOS3比其他DP的GOS具有更好的促进粘液基因表达的作用,从而提高肠道的屏障功能并降低炎症反应。本研究对Tn0602的双位点叠加突变为β-葡萄糖苷酶的改造提供了新的思路,初步确定GOS3是GOS主要功能成分,具有重要的研究和应用价值。

关键词： β-葡萄糖苷酶叠加突变 GOS3 转糖基黏液基因2

新型α-半乳糖苷酶的异源表达及酶学特性研究

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新型α-半乳糖苷酶的异源表达及酶学特性研究

作者：陆倩云南师范大学

学位级别：硕士

α-半乳糖苷酶是一种广泛存在于自然界中的糖苷水解酶,根据氨基酸序列的同源性将不同来源的α-半乳糖苷酶分为糖苷水解酶(GH)的4、27、36、57和110家族,这5个家族的α-半乳糖苷酶均能催化水解含有α-连接的末端非还原性D-半乳糖的低聚... 详细信息

α-半乳糖苷酶是一种广泛存在于自然界中的糖苷水解酶,根据氨基酸序列的同源性将不同来源的α-半乳糖苷酶分为糖苷水解酶(GH)的4、27、36、57和110家族,这5个家族的α-半乳糖苷酶均能催化水解含有α-连接的末端非还原性D-半乳糖的低聚多糖、脂多糖和多聚糖。其中,一部分α-半乳糖苷酶不仅具有水解活性还具有糖基转移活性,使其在饲料、食品、化工、制糖和医药领域的应用前景备受关注。目前,尚未有来源于Mesorhizobium sp.和Pontibacter sp.的α-半乳糖苷酶的报道,也未有文献显示GH27家族α-半乳糖苷酶具有转糖基活性,而微生物来源具有双最适pH的碱性α-半乳糖苷酶的报道也极少。基于α-半乳糖苷酶的应用价值,本研究选择将分别来源于Mesorhizobium sp.、Streptomyces sp.和Pontibacter sp.的3个酶编码基因agaAJB07、agaAHJG4和agaAHJ8连接到pEASY-E2载体上,得到重组质粒,并将构建好的重组质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达。利用C端的组氨酸标签对表达获得的重组GH36家族α-半乳糖苷酶AgaAJB07、AgaAHJG4和重组GH27家族α-半乳糖苷酶AgaAHJ8进行纯化,并对纯化酶进行了酶学特性研究,结果表明:(1)重组酶AgaAJB07最适pH为6.5,在pH 7.0–9.0的范围内具有良好的稳定性;最适温度为45℃,50℃时的热稳定性良好;对蛋白酶K和胰蛋白酶具有一定抗性;0.5mmol/L的ZnSO4和30mmol/L的PbAc对该酶具有最大促进作用,可分别提高酶活约0.4倍和10.4倍。该酶在水产动物养殖中具有一定的应用潜力,且能为抗Zn2+和Pb2+机制的研究提供良好的模型材料。(2)重组酶AgaAHJG4的最适pH为双峰,分别为8.0和9.5,在pH 7.5–10.0范围内具有较好的稳定性;最适温度为35℃,在10℃和20℃时分别具有19.3%和35.3%的酶活,热稳定性较差。由于种子吸胀萌发过程中碱性α-半乳糖苷酶活性与种子脱水耐性有潜在关系,因此该酶在改善种子脱水耐性方面有一定潜在价值。(3)重组酶AgaAHJ8的最适pH为5.5,在pH 4.0–8.0范围内具有较好的稳定性;该酶最适温度为50℃,热稳定性差,具有良好的NaCl、Zn2+和Pb2+抗性。该重组酶在耐盐、耐Zn2+和耐Pb2+机制研究方面具有一定的理论价值,在饲料和食品领域中也具有潜在的应用前景。(4)TLC和质谱检测结果表明AgaAJB07、AgaAHJG4和AgaAHJ8均有转糖基活性,以pNPG为半乳糖基供体,AgaAJB07的糖基受体为葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、果糖、山梨糖、乳糖、乙醇、异丙醇、甘油、山梨醇、甘露醇;AgaAHJG4的糖基受体为半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、水苏糖、棉子糖;AgaAHJ8的糖基受体为蔗糖、棉子糖和异戊醇。以底物自身做供体和受体时AgaAJB07对p NPG和蜜二糖具有活性;AgaAHJG4对pNPG、水苏糖和蜜二糖具有活性。综上,本研究获得了具有新型酶学特性的2个GH36家族和1个GH27家族α-半乳糖苷酶。其中Mesorhizobium sp.来源的α-半乳糖苷酶AgaAJB07具有酶活性能被高浓度Zn2+和Pb2+促进和转糖基受体多样的特性;Streptomyces sp.来源的α-半乳糖苷酶AgaAHJG4具有碱性双pH和低温活性的特性;Pontibacter sp.来源的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8(GH27)具有耐Zn2+、耐Pb2+、耐Na+和转糖基活性的特性。它们不仅为α-半乳糖苷酶的相关活性机理研究提供了有价值的素材,还在食品、水产饲料等领域中具有一定的开发应。

关键词： α-半乳糖苷酶酶学特性转糖基协同作用

粪便微生物宏基因组来源的β-半乳糖苷酶的异源表达及酶学性质研究

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粪便微生物宏基因组来源的β-半乳糖苷酶的异源表达及酶学性质研究

作者：张文洪云南师范大学

学位级别：硕士

乳糖是哺乳动物乳汁及乳制品中存在的主要碳水化合物,当人们饮用牛奶后,在消化过程中乳糖必须被β-半乳糖苷酶催化水解为半乳糖和葡萄糖才能被机体吸收利用。据报道,世界上约有十分之一的人由于体内缺乏β-半乳糖苷酶而患有乳糖不耐受症... 详细信息

乳糖是哺乳动物乳汁及乳制品中存在的主要碳水化合物,当人们饮用牛奶后,在消化过程中乳糖必须被β-半乳糖苷酶催化水解为半乳糖和葡萄糖才能被机体吸收利用。据报道,世界上约有十分之一的人由于体内缺乏β-半乳糖苷酶而患有乳糖不耐受症;饮用牛奶后,身体会出现腹泻、呕吐等不良反应。其中,β-半乳糖苷酶具有很大的商业利用情景,性质优良的β-半乳糖苷酶在生产生活中具有重要的实用价值。β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶的一种,广泛存在于自然界中。根据氨基酸序列的相似性,将β-半乳糖苷酶归入五种糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GH)家族,包括1、2、35、42和59家族。其中,部分β-半乳糖苷酶除了具有水解活性以外,还具有转糖基活性。目前,对β-半乳糖苷酶的研究较多,但尚未有来源于动物胃肠道且具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶报道,以及很少有报道具有耐盐性的β-半乳糖苷酶;由于β-半乳糖苷酶被广泛应用于食品工业、医学和生化分析等邻域,耐盐与否与其运用前景息息相关。本论文研究的β-半乳糖苷酶来源于滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA,通过PCR克隆得到基因galRBM20、galRBM20、galRBM203和galRBM205,配合pEASY-E2载体和宿主Escherichia coli BL21(DE3)菌种构建原核表达系统,分别对其进行异源表达和纯化,并对纯化后的重组酶galRBM20、galRBM20、galRBM203和galRBM205进行酶学性质研究,结果表明:(1)重组酶galRBM20最适pH为5.0,在pH 4.0-7.0之间仍能保持70%及其以上的活性,在pH 5.0-8.0的范围内具有良好的稳定性;最适温度为45℃,37℃和45℃下具有良好的稳定性;大多数金属离子和化学试剂对该酶的活性都具有激活作用;其耐盐性较强,当反应环境中有适当浓度的NaCl或是经一定浓度范围内的NaCl处理后,能明显提高酶的活力。(2)重组酶galRBM20最适pH为7.0,在pH 7.0-9.0之间仍能保持70%及其以上的活性;在pH 5.0-7.0的范围内具有良好的稳定性;该酶温度稳定性良好,最适温度为45℃,55℃处理1 h后还具有45%以上的活性;大多数金属离子和化学试剂对该酶的活性都具有激活作用;该酶具有良好的耐盐性,经一定浓度范围内的NaCl处理后,酶的活力明显提高。(3)重组酶galRBM203最适pH为7.0,在pH 7.0-9.0之间仍能保持70%及其以上的活性;最适温度为45℃,在37℃、45℃、50℃和55℃下稳定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg、Fe对该酶的活性具有明显的激活作用;该酶具有良好的耐盐性,且一定浓度范围内的NaCl处理能提高酶的活力。(4)重组酶galRBM205最适pH为8.0,在pH 7.0-9.0之间仍能保持70%及其以上的活性;galRBM205受pH的激活作用较强,在pH 5.0-10.0的范围内处理1 h后,酶活均在100%以上,其中pH 10处理1h后,相对酶活达到180%以上;最适温度为45℃,50℃和55℃下稳定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg、Mn对该酶的活性具有明显的激活作用;该酶具备一定的耐盐性,当反应环境中有2 M的NaCl存在时,仍具有55%的活性。TLC检测结果表明,重组酶galRBM20、galRBM20、galRBM203和galRBM205除了能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖以外,还具有转糖基活性;为此,本研究获得的β-半乳糖苷酶不仅能很好的水解乳清、干酪和牛乳(pH 5.0-7.0),而其在具有盐溶液的反应中能发挥良好的反应潜能,较适应β-半乳糖苷酶的广泛用途。

关键词：粪便微生物宏基因组 β-半乳糖苷酶耐盐性转糖基