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一个用于转染细胞分选的双顺反子载体的构建及其应用

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生物化学与生物物理进展 2005年第9期32卷 889-894页

作者：曲笑霞秦立蓬岳文高艳红李艳华袁红丰王韫芳刘大庆闫舫施双双裴雪涛军事医学科学院输血研究所干细胞研究室北京100850

为简化转染细胞的分选过程,构建了一个含有细胞表面标志CD34基因的双顺反子载体p3.1-IRES-CD34.利用来源于脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES),实现目的基因与CD34基因的共同表达.将绿色荧光蛋白(EGFP)作为目的基因插入载体... 详细信息

为简化转染细胞的分选过程,构建了一个含有细胞表面标志CD34基因的双顺反子载体p3.1-IRES-CD34.利用来源于脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES),实现目的基因与CD34基因的共同表达.将绿色荧光蛋白(EGFP)作为目的基因插入载体的多克隆位点,然后转染NIH-3T3细胞,通过免疫磁珠分选(MACS)方法来分选细胞.结果表明:对于转染细胞,均可实现快速分选(瞬时转染细胞约48h,稳定转染10￣15天),并且获得较高纯度(95%以上)的表达目的基因细胞.

关键词：载体转染细胞分选 CD34

转染CD40L基因对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响

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肿瘤 2010年第9期30卷 728-734页

作者：武立华张超单保恩艾军河北医科大学第四医院暨河北省肿瘤研究所免疫室石家庄050011

目的:本研究通过将CD40L基因转染小鼠结肠癌colon26细胞,观察其对小鼠结肠癌细胞生物学特性的影响,以期探讨CD40L作为结肠癌基因治疗靶点的可行性。方法:经脂质体将CD40L基因转染小鼠结肠癌colon26细胞后,采用半定量RT-PCR法、Western... 详细信息

目的:本研究通过将CD40L基因转染小鼠结肠癌colon26细胞,观察其对小鼠结肠癌细胞生物学特性的影响,以期探讨CD40L作为结肠癌基因治疗靶点的可行性。方法:经脂质体将CD40L基因转染小鼠结肠癌colon26细胞后,采用半定量RT-PCR法、Western印迹法和激光共聚焦显微镜检测CD40L mRNA及蛋白的表达情况,新型四氮唑盐MTS比色法检测CD40L基因转染对细胞生长的影响,FCM法检测其对细胞表面分子表达的影响,半定量RT-PCR法检测细胞中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)mRNA的表达情况,以及Transwell法检测细胞的侵袭能力变化。结果:RT-PCR检测结果显示,转染CD40L基因的小鼠结肠癌colon26细胞中CD40L mRNA的表达量为1.09±0.12,与转染空质粒细胞和未转染细胞相比,分别上调了59.21%和58.33%,差异有统计学意义(P转染后colon26/CD40L细胞中MMP-2 mRNA水平降低。MTS法检测结果显示,colon26/CD40L细胞的生长速度与未转染细胞无明显变化。FCM法检测结果显示,colon26/CD40L细胞表面共刺激分子CD80和CD86水平升高。同时,Transwell实验结果显示,colon26/CD40L细胞侵袭能力下降(P细胞的免疫原性,降低了结肠癌细胞的侵袭能力,抑制了结肠癌细胞的恶性表型。

关键词：基因转染 CD40L基因小鼠结肠癌癌细胞增殖细胞侵袭能力 colon cancer cells cell proliferation colon26细胞检测结果结肠癌细胞 Transwell 转染细胞细胞表面检测细胞表达 RT-PCR法检测 mRNA 细胞生物学特性基质金属蛋白酶 Western印迹法

用于转染细胞分选的双顺反子载体的构建及其应用

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用于转染细胞分选的双顺反子载体的构建及其应用

作者：曲笑霞中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

将外源基因导入哺乳动物细胞并获得表达外源基因的细胞系,在生物学及基础医学研究中有着广泛的应用。动物细胞被外源基因转化通常是一种低效率的过程,在几万或几十万个细胞中仅有少数几个细胞可整和外源基因,即使对于高效率的转化方法,... 详细信息

将外源基因导入哺乳动物细胞并获得表达外源基因的细胞系,在生物学及基础医学研究中有着广泛的应用。动物细胞被外源基因转化通常是一种低效率的过程,在几万或几十万个细胞中仅有少数几个细胞可整和外源基因,即使对于高效率的转化方法,所产生的转化株也是少数。如何从大量的未转染的细胞中选出转化株,是基因转移技术十分关键的一环。传统的方法中,用于哺乳动物细胞基因工程的载体通常需要外加一个遗传标记基因以便于进行选择。例如,利用载体携带的抗生素抗性基因,通过一定浓度的选择性培养基进行一段时间的加压培养,然后挑取单克隆扩大培养,经过鉴定获得所要的细胞系。但是载体中由于目的基因和抗生素抗性基因分别由不同的启动子启动,往往不能实现共同表达,所以采用传统的方法获得表达目的基因的细胞系,工作量大,所需时间也长。免疫磁珠分选(Magnetic Cell Sorting,MACS)技术由于其快速、高效并且具有可供利用的试剂盒等特点,目前已广泛应用于细胞的分选。此项技术基于抗体对细胞表面抗原的特异识别,将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上,在磁场作用下达到分离细胞的目的。我们将MACS分选技术引入到转染细胞的分选中,通过构建一个带有细胞表面标记基因CD34的双顺反子载体,使转染细胞在表达目的基因的同时表达CD34标记基因,然后通过MACS分选来获得所需的表达目的基因的细胞系。 CD34是属于Ⅰ型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白,主要表达于造血干/祖细胞(hematopoietic stern/progenitor cell,HSC/HPC)上。我们利用从CD34细胞中提取的RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增得到CD34的一种人工截短体形式dCD34(delected variant of CD34)。将其克隆入pGEM-T-easy载体中,测序证明其包含了完整的胞外域及跨膜部分,但是缺失了胞内域。为了实现目的基因与CD34基因的共表达,我们采用内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)序列构建了双顺反子表达载体。在上游启动子的控制下,IRES序列及与之相连的基因可同时转录,并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译,从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白。我们将酶切得

关键词：双顺反子载体转染细胞分选 CD34

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人Blys转染细胞对B细胞功能的影响

现代免疫学 2005年第2期25卷 122-125,144页

作者：徐海燕於葛华刘琳郑路李文香施勤邱玉华张学光苏州大学生物技术研究所

利用RT-PCR方法从经IFN-γ激发的正常人外周血单核细胞总RNA中扩增出全长BlyscDNA,继而将BlyscDNA插入真核表达载体逆转录病毒载体pSIV1中。以脂质体转染法将重组逆转录病毒载体与两个辅病毒载体共转染包装细胞293T,将含完整病毒颗粒的... 详细信息

利用RT-PCR方法从经IFN-γ激发的正常人外周血单核细胞总RNA中扩增出全长BlyscDNA,继而将BlyscDNA插入真核表达载体逆转录病毒载体pSIV1中。以脂质体转染法将重组逆转录病毒载体与两个辅病毒载体共转染包装细胞293T,将含完整病毒颗粒的上清转染小鼠成纤维细胞L929,经G418筛选获得稳定表达Blys分子的L929细胞;RT-PCR和流式细胞术检测证实Blys分子在L929的稳定和高水平表达。继而以该转染细胞与PWM驱动的人扁桃体B细胞共培养,体外实验表明Blys介导的共刺激信号能促进该培养体系B淋巴细胞增殖,与抗μ抗体信号协同能刺激B细胞分泌IgG。

关键词： Blys 转染细胞增殖

应用TNF基因转染细胞进行的肿瘤实验性免疫疗法(英文)

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中国肿瘤生物治疗杂志 1995年第1期2卷 66-72页

作者：秦志海 BlankensteinT Max-Delbr(?)ck-CenterofMolecularMedicine

基因修饰的肿瘤细胞所分泌的TNF(肿瘤坏死因子)能够主要通过诱导机体的抗肿瘤免疫反应而使机体产生强大的抗肿瘤免疫功能,这一效应的发挥需要肿瘤局部TNF的持续的存在并具有剂量依赖性,同时不应伴有全身性毒副作用.在体内,分泌TNF的肿... 详细信息

基因修饰的肿瘤细胞所分泌的TNF(肿瘤坏死因子)能够主要通过诱导机体的抗肿瘤免疫反应而使机体产生强大的抗肿瘤免疫功能,这一效应的发挥需要肿瘤局部TNF的持续的存在并具有剂量依赖性,同时不应伴有全身性毒副作用.在体内,分泌TNF的肿瘤细胞局部浸润的细胞主要是巨噬细胞及CD4^+和CD8^+T淋巴细胞,由于在有效的抗肿瘤免疫反应中必需巨噬细胞及CD8^+T细胞的参与,CD4^+T细胞似为无辜旁观者细胞.肿瘤细胞所分泌的TNF在T细胞缺陷鼠中也有一定作用,但大多数资料表明T细胞对于肿瘤细胞的完全清除是必需的.根据所选择的肿瘤细胞类型及转染细胞所分泌的TNF水平,TNF所引起的实验动物全身性毒副作用包括恶液质及消瘦、部分体内实验结果表明,TNF基因转染的肿瘤细胞不仅不能抑制肿瘤细胞的生长,反而会促进肿瘤的转移.将TNF基因转染的肿瘤细胞制备的瘤苗也不能使机体对亲本肿瘤的侵袭产生保护性免疫反应.

关键词： TNF基因肿瘤细胞分泌抗肿瘤免疫反应转染细胞全身性免疫疗法实验动物 CD8^+ CD4^+

转染人骨形态发生蛋白-2基因的羊骨髓间充质干细胞的异位成骨研究

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中华骨科杂志 2003年第8期23卷 489-492页

作者：汤亭亭徐小良戴鮨戎郁朝锋朱六龙楼觉人上海第二医科大学附属第九人民医院骨科 200011 美国华盛顿大学医学院骨科研究室

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利... 详细信息

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利用免疫沉淀和Westernblot方法检测BMP-2的表达,并在体外进行碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色、ALP定量测定、透射电镜观察。分别将细胞悬液注入裸鼠股后部肌内,分期进行X线和组织学检查。结果Westernblot检测发现只有hBMP-2转染细胞组的MSCs表达并分泌hBMP-2。该组于转染后第12d,ALP活性达高峰,与其它两组比较,差异有显著性意义;于16d后出现钙结节,而其它两组未见。透射电镜观察见hBMP-2转染细胞组的细胞内粗面内质网、线粒体和溶酶体增多。裸鼠肌内注射细胞悬液后3周,hBMP-2转染细胞组即有异位成骨,6周时明显增多,其它两组仅见纤维组织形成或微量成骨。结论hBMP-2基因转染能诱导羊MSCs分化为成骨细胞,并在裸鼠体内诱导成骨。

关键词： hBMP-2 转染细胞异位成骨骨形态发生蛋白-2 骨髓间充质干细胞裸鼠基因转染人骨细胞悬液内质网

反义T-STAR基因转染降低肺腺癌A549细胞端粒酶活性

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第三军医大学学报 2005年第11期27卷 1127-1129页

作者：张玲郭莲彭勇陈兵第三军医大学西南医院军人门诊部重庆400038 第三军医大学西南医院内分泌科重庆400038

目的　通过反义技术抑制肺腺癌A5 49细胞T STAR (testes signaltransductionandactivatorofRNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响。方法　用阳性脂质体法将T STAR反义基因转染入A5 49细胞,用RT PCR及Westernblot方法检测转染... 详细信息

目的　通过反义技术抑制肺腺癌A5 49细胞T STAR (testes signaltransductionandactivatorofRNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响。方法　用阳性脂质体法将T STAR反义基因转染入A5 49细胞,用RT PCR及Westernblot方法检测转染细胞内源性T STAR基因mRNA和蛋白表达水平,并用PCR ELISA法检测细胞端粒酶活性改变。结果　反义基因可在mRNA及蛋白水平有效抑制肺腺癌A5 49T STAR基因的表达,同时明显降低细胞端粒酶活性。结论　肺腺癌A5 49细胞T STAR基因表达的抑制可能下调端粒酶活性。

关键词：细胞端粒酶活性肺腺癌A549细胞 activator ELISA法检测 T-STAR基因 Western 反义基因转染 RT-PCR 蛋白表达水平基因mRNA 反义技术脂质体法转染细胞 blot 活性改变蛋白水平基因表达内源性抑制 and

Tet-on基因表达系统转染胚胎干细胞和调控效应检测

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中国科学（C辑） 2005年第3期35卷 192-195页

作者：王彦丛笑倩刘德莉张文杰崔磊刘伟曹谊林上海第二医科大学第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011

以荧光素酶基因为目的基因,应用Lipofectamine介导的瞬时转染方法,将pTet-on调控质粒和pTRE2hyg-luciferase表达质粒共转染小鼠胚胎干细胞,滴加系列浓度的DOX后,观察其诱导效应.结果显示,随DOX浓度升高,荧光素酶的活性也逐渐增强;而未... 详细信息

以荧光素酶基因为目的基因,应用Lipofectamine介导的瞬时转染方法,将pTet-on调控质粒和pTRE2hyg-luciferase表达质粒共转染小鼠胚胎干细胞,滴加系列浓度的DOX后,观察其诱导效应.结果显示,随DOX浓度升高,荧光素酶的活性也逐渐增强;而未转染细胞与转染细胞未加诱导剂时,其RLU值均接近空白对照.表明转染Tet-on基因表达系统的胚胎干细胞对DOX诱导有较好的反应性,目的基因的表达与DOX具有严格的剂量依赖关系.

关键词：基因表达系统调控效应小鼠胚胎干细胞检测荧光素酶基因目的基因转染细胞表达质粒诱导效应依赖关系共转染诱导剂反应性 LU值浓度

IGF-Ⅱ基因RNAi慢病毒载体构建与稳定转染细胞株建立

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广西医学 2012年第6期34卷 677-680页

作者：杨翠英罗佐杰广西医科大学第一附属医院内分泌科南宁市530021

目的构建人的IGF-Ⅱ基因RNA干扰慢病毒载体并建立人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13稳定转染细胞株。方法根据人的IGF-Ⅱ基因序列,设计3条针对IGF-Ⅱ-shRNA序列,分别构建pLLU2G-shIGF-Ⅱ3个慢病毒载体。筛选出最有效沉默靶基因的shRNA后,将携... 详细信息

目的构建人的IGF-Ⅱ基因RNA干扰慢病毒载体并建立人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13稳定转染细胞株。方法根据人的IGF-Ⅱ基因序列,设计3条针对IGF-Ⅱ-shRNA序列,分别构建pLLU2G-shIGF-Ⅱ3个慢病毒载体。筛选出最有效沉默靶基因的shRNA后,将携带目的序列的慢病毒载体转染到293FT细胞中,感染人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13,建立稳定转染细胞株。结果设计的针对IGF-Ⅱ的序列中第3条的抑制效果最好,下调80%。以此目的序列构建稳定转染细胞株,对IGF-ⅡmRNA抑制率达95%。结论成功构建表达人肾上腺皮质瘤IGF-Ⅱ-shRNA的慢病毒载体,它能有效沉默IGF-Ⅱ基因在人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13中的表达并建立稳定转染细胞株。

关键词： IGF-Ⅱ RNAi SW-13 shRNA 慢病毒载体转染细胞