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一种新的非病毒基因转移载体及其体外细胞转染活性研究

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生物技术 2004年第4期14卷 11-13页

作者：刘永军李亚萍李军刘镭超英生物医学研究开发有限公司基础研究中心

目的 :用低分子量的聚乙亚胺 (PEI)有效地进行基因转染 ,为基因转染在基因治疗中的应用提供一种可靠、廉价、高效的方法。方法 :将带有绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺 (PEI)结合 ,用肝癌细胞系SMMC77... 详细信息

目的 :用低分子量的聚乙亚胺 (PEI)有效地进行基因转染 ,为基因转染在基因治疗中的应用提供一种可靠、廉价、高效的方法。方法 :将带有绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺 (PEI)结合 ,用肝癌细胞系SMMC772 1实验 ,研究PEI分子量与转染活性以及可能引起的细胞毒性之间的关系 ;进一步研究在血清存在的情况下 ,PEG(聚乙二醇 80 0 0 )、叶酸等物质对PEI介导的转染效率的影响。结果 :分子量为 6 0 0Da的PEI在pH值为 6 0时与质粒DNA以 1∶1的质量比混合 ,细胞转染效率最高为 4 3 6 + - 7 3% ,随着分子量的增大 ,转染活性略有下降 ;进一步研究发现 ,在血清存在下 ,2 0 μM的叶酸和 15 %的PEG能有效地改善PEI介导的转染活性 ,使其转染活性提高了 13% ;用光学相差显微镜检测了PEI潜在的细胞毒性 ,结果发现分子量为 6 0 0Da的PEI没有使细胞形态改变或死亡 ,但是随着分子量的增大 ,PEI潜在的细胞毒性也相应增大。结论 :PEI是一种高效、有用的非病毒载体 ,能够在培养的哺乳动物细胞中进行基因转移 ,这对疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。

关键词：非病毒载体转染活性体外

负载siBcl-2磷酸钙脂质混合纳米粒的制备及其抗肿瘤活性研究

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负载siBcl-2磷酸钙脂质混合纳米粒的制备及其抗肿瘤活性研究

作者：蔡容巧第四军医大学

学位级别：硕士

目的:siRNA能高效且特异地阻断目的基因的表达,但siRNA在体循环中易被降解,不能有效到达病变部位发挥作用。因此构建合适的递药系统将siRNA递送至靶部位,是siRNA发挥疗效的首要条件。为了改善siRNA在体内的转染活性,本文合成了柠槺酸修... 详细信息

目的:siRNA能高效且特异地阻断目的基因的表达,但siRNA在体循环中易被降解,不能有效到达病变部位发挥作用。因此构建合适的递药系统将siRNA递送至靶部位,是siRNA发挥疗效的首要条件。为了改善siRNA在体内的转染活性,本文合成了柠槺酸修饰的胆固醇衍生物,将其修饰于负载siRNA的磷酸钙脂质混合纳米粒表面,旨在构建一种具备电荷翻转功能的性能良好的siRNA递送系统,改善其在血液循环中的稳定性,有利于脂质混合纳米粒将siRNA释放到细胞浆,以期提高siRNA的体内转染活性。方法:(1)以胆固醇(CHOL)、6-氨基己酸(AA)和柠槺酸酐(Cit)为原料,通过化学合成得到化合物3(CHOL-AA)和化合物4(CHOL-AA-Cit),波谱学方法鉴定合成产物结构。(2)以靶向Bcl-2的siRNA(siBcl-2)为模型基因,采用微乳法制备磷酸钙纳米核,薄膜分散法制备负载siBcl-2的磷酸钙脂质混合纳米粒(LNPS@siBcl-2),通过改变脂质外层dotap、化合物3和化合物4的含量优化处方。通过纳米粒度及zeta电位分析仪和透射电镜表征纳米粒。(3)采用mtt实验检测未负载sibcl-2的空白磷酸钙脂质混合纳米粒对a549细胞的毒性;以lipofectamine2000@sibcl-2为阳性对照,检测lnps@sibcl-2对a549细胞的毒性。通过caspase-3活性检测试剂盒检测lnps@sibcl-2纳米粒对a549细胞中caspase-3活性的影响。westernblot方法检测lnps@sibcl-2纳米粒对bcl-2蛋白的沉默效应,并检测调亡相关蛋白bax和caspase-3的表达,探讨lnps@sibcl-2纳米粒诱导a549细胞凋亡的机制。(4)通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2纳米粒的摄取,以及转运cy5-sibcl-2在a549细胞内的分布情况,并对a549细胞摄取lnps@cy5-sibcl-2的机制进行研究;利用a549细胞建立体外三维a549细胞球模型,激光共聚焦显微镜检测lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2在a549细胞球中的穿透能力。(5)构建裸鼠a549细胞移植瘤模型,以生理盐水为空白对照,lnps@scrambledbcl-2为阴性对照,检测lnps@sibcl-2的体内抗肿瘤活性;荷瘤裸鼠尾静脉注射lnps@sibcl-2后,每隔三天记录一次肿瘤的体积和裸鼠的体重变化情况。裸鼠尾静脉注射lnps@cy5-sibcl-2后,分离主要脏器和肿瘤组织,活体成像仪检测lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2在荷瘤裸鼠主要脏器及肿瘤组织的分布;制备脏器和肿瘤组织冰冻切片,通过dapi染色,激光共聚焦显微镜检测lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2在各脏器和肿瘤组织切片的分布;h&e染色观察荷瘤裸鼠主要脏器和肿瘤组织的形态变化。治疗结束后,取治疗组和对照组裸鼠肿瘤组织,匀浆后提取肿瘤组织总蛋白。westernblot检测肿瘤组织bcl-2,bax和caspase-3的表达。结果:(1)经波谱学鉴定,合成产物为目标产物。通过处方筛选,得到的最优处方为:chol-aa/dotap/chol-aa-cit=150/225/150(体积,三个脂质浓度均为10mmol/l)。制备的负载sibcl-2磷酸钙脂质混合纳米粒在ph7.4条件下平均粒径为80nm,zeta电位为-13mv;ph5.0条件下,粒径为1506nm,zeta电位为+9mv。(2)mtt实验结果显示,空白磷酸钙脂质纳米粒对a549细胞没有细胞毒性;体外转染活性实验结果表明,lnps@sibcl-2能浓度依赖性地抑制a549细胞的增长且转染活性优于阳性对照lipofectamine2000@sibcl-2;caspase-3活性检测试剂盒检测结果显示lnps@sibcl-2纳米粒能浓度依赖的上调a459细胞中caspase-3的活性;westernblot结果显示,lnps@sibcl-2能下调a549细胞bcl-2的表达,同时上调bax和caspase-3的表达,且呈浓度依赖性。上述结果提示lnps@sibcl-2通过下调bcl-2的表达,上调bax和caspase-3的表达发挥体外抗肿瘤活性。(3)流式细胞仪和激光共聚焦检测结果显示,随着孵育时间的增长,a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取量增加;孵育介质ph降低,a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取量增加。提示a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取呈现时间依赖性和ph依赖性。低温(4℃)和atp消耗剂均能抑制a549细胞对lnps@

关键词：脂质混合纳米粒磷酸钙电荷翻转 siBcl-2 siRNA 转染活性

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壳聚糖纳米粒用作基因递送载体的初步研究

药学学报 2002年第12期37卷 981-985页

作者：黄伟崔光华贺俊峰周旭张强军事医学科学院毒物药物研究所北京100850 辽宁师范大学化学系辽宁大连116029 北京大学药学院药剂教研室北京100083

目的　初步研究基因壳聚糖纳米粒的性质和转染活性。方法　用复凝聚法制备纳米粒 ;用透射电镜观察形态 ;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位 ;用荧光分光光度法测定基因包封率 ;用凝胶阻滞分析和荧光扫描测定基因在纳米粒中... 详细信息

目的　初步研究基因壳聚糖纳米粒的性质和转染活性。方法　用复凝聚法制备纳米粒 ;用透射电镜观察形态 ;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位 ;用荧光分光光度法测定基因包封率 ;用凝胶阻滞分析和荧光扫描测定基因在纳米粒中的位置 ;用体外基因转染实验定性评价纳米粒的转染活性。结果　纳米粒形态多呈球形 ,平均粒径为 2 18 9nm ,多分散度为 0 2 76 ,zeta电位为 +2 1 2mV ;基因包封率为 99 6 %;凝胶阻滞分析和荧光扫描表明基因几乎全部被包裹在纳米粒内部 ,表面吸附很少 ;体外基因转染实验表明基因壳聚糖纳米粒能够转染人胚胎肾细胞 (HEK2 93)和肝癌细胞 (HepG2 ) ,基因能够在这两种细胞中表达。结论　壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内并且基因能够表达 ,因此可以用作基因药物载体。

关键词：基因递送壳聚糖纳米粒基因载体复凝聚法转染活性荧光扫描

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PEI在动物皮肤组织基因转化中的应用研究

生物工程学报 2007年第1期23卷 166-170页

作者：刘永军张爱宁薛小平西安建筑科技大学环境与市政工程学院西安710055 西北工业大学生命科学院西安710072

用低分子量的聚乙亚胺（PEI）开发一种新的非病毒基因转染系统，为基因在皮肤组织中的有效转染提供一种可靠、廉价的方法。将带有绿色荧光蛋白报告基因（gfp）的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺结合，用肝癌细胞株CM7721试验，研究... 详细信息

用低分子量的聚乙亚胺（PEI）开发一种新的非病毒基因转染系统，为基因在皮肤组织中的有效转染提供一种可靠、廉价的方法。将带有绿色荧光蛋白报告基因（gfp）的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺结合，用肝癌细胞株CM7721试验，研究其转染效率及可能引起的细胞毒性；进一步转染小鼠皮肤组织，研究转染基因的表达位置及持续表达时间。结果发现，低分子量PEI介导的细胞转染效率最高可达55％，转染效率与PEI结构无关（P〉0．05），但是随着PEI分子量的增加，其转染活性略有下降。同时，随着分子量的增加，PEI对细胞的毒性也相应加大；小鼠皮肤转染实验显示，转染24h后，gfp即可在皮肤组织的毛囊、汗腺、皮脂腺等处高效表达，表达可持续7～9d；进一步对皮肤用氮酮、维甲酸处理后，gfp可在皮肤组织的颗粒层细胞中高效表达。PEI是一种高效、有用的非病毒基因转染载体，能够在体外培养的动物细胞及动物皮肤组织中进行基因转移，这对皮肤疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。

关键词：聚乙亚胺(PEI) 绿色荧光蛋白(GFP) 皮肤组织转染活性

一种新型基因载体--SucPG络合物的研究进展

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生物技术通报 2009年第2期25卷 38-42页

作者：张书民乔卫红刘栋良大连理工大学精细化工国家重点实验室大连116012 东华大学化学与化工学院上海201620

简要介绍了一种新型基因载体——SucPG络合物的研究进展,它由连有转铁蛋白的SucPG(琥珀酰多聚甘油)修饰的脂质体与lipoplex络合形成,具有较高的转染活性,抗血清性和毒性低等一系列的优点。

关键词：基因载体 SucPG络合物转染活性抗血清性毒性

以人体内源单体精胺为基本单元构建的基因载体的合成、表征及生物检测

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以人体内源单体精胺为基本单元构建的基因载体的合成、表征及生物...

作者：刘成容吉林大学

学位级别：硕士

本研究以人体内源性单体-精胺作为基本结构单元,分别以琥珀酰氯和乙二醇二氯甲酸酯为连接剂,合成Polyamide-SP及Polycarbam-SP,再用单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)封闭高分子的末端,以屏蔽高分子在溶液中过多的正电荷,最终... 详细信息

本研究以人体内源性单体-精胺作为基本结构单元,分别以琥珀酰氯和乙二醇二氯甲酸酯为连接剂,合成Polyamide-SP及Polycarbam-SP,再用单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)封闭高分子的末端,以屏蔽高分子在溶液中过多的正电荷,最终我们得到目标高分子PEG-Polyamide-SP和PEG-Polycarbam-SP。两种高分子与DNA复合后的纳米颗粒在纯水中大粒径在100-120nm之间,生理盐水中粒径为150-200nm。ζ电位在+10-20mV。COS-7和Hep G2细胞的荧光素酶质粒转染结果显示:PEG-Polyamide-SP和PEG-Polycarbam-SP的转染效率与阳性对照PEI25kDa和Lipofectamine 2000相当,且远远高于单体精胺。且随着高分子浓度增加PEG-Polyamide-SP和PEG-Polycarbam-SP对COS-7、Hep G2细胞和RAW264.7细胞的细胞毒性远远低于PEI25kDa。其中PEG-Polyamide-SP毒性最小,低于Lipofectamine 2000。本研究表明不同连接剂可以在很大程度上影响高分子的转染活性和细胞毒性。我们合成的化合物与商品化的PEI25kDa相比活性相当但显示出了更低的毒性。且化合物本身可降解为人体内源性的单体实现无毒化代谢,相比于病毒载体具有更小的基因毒性。化合物结构上具有进一步修饰的可能,为更高效的转染试剂的开发和临床研究提供了新的思路和方法。

关键词：精胺内源性单体聚阳离子转染活性毒性

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刺激响应型阳离子基因载体的合成及转染研究

刺激响应型阳离子基因载体的合成及转染研究

作者：林国清西南民族大学

学位级别：硕士

基因治疗指的是一种利用DNA重组技术将功能化核酸分子(DNA或RNA)导入靶细胞,纠正或补偿疾病基因,使细胞完全(或部分)恢复正常的生理代谢状态从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因治疗的优势在于其能从根本上(基因水平)治疗疾病,... 详细信息

基因治疗指的是一种利用DNA重组技术将功能化核酸分子(DNA或RNA)导入靶细胞,纠正或补偿疾病基因,使细胞完全(或部分)恢复正常的生理代谢状态从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因治疗的优势在于其能从根本上(基因水平)治疗疾病,目前基因治疗面临的存在的主要技术难题在于缺乏安全高效的基因传递载体。常用的基因载体主要包含病毒载体和非病毒载体两类。虽然病毒载体有着较高的转染效率,但是它存在安全风险、免疫原性、基因传递尺寸大小限制及价格昂贵等弊端。阳离子聚合物和阳离子脂质体作为常用的非病毒基因载体,由于其具有结构多样、易于修饰功能化、良好生物相容性,较低毒性且可降解性等优点,具有成为优秀基因载体的潜力,近年受到越来越多研究者们的关注。本文第一章简介了基因治疗和基因载体,综述了刺激响应型的阳离子基因载体、基因转染过程和基因转染所面临的问题以及解决方法。第二章,我们通过开环聚合将含有刺激响应型硫代缩醛基团的二环氧化物与低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)反应,设计、合成了四个活性氧(ROS)响应型的阳离子聚合物。通过系列的生化实验研究,我们发现这些阳离子聚合物具有良好的DNA结合能力,与DNA形成的复合物具有合适的粒径(180～300 nm)和zeta电位(+35～50 mV)。此外,复合物对血清稳定但在ROS条件下分解。体外细胞实验表明,这些阳离子聚合物具有较低的细胞毒性,转染效率高于商品化试剂Lipofectamine 2000和25 KDa PEI。在10%血清的存在下,聚合物的转染效率甚至比25 KDa PEI高10倍,比Lipofectamine 2000高9倍,具有作为潜在转染试剂的能力。第三章,我们设计合成了四个以荧光染料萘二甲酰作为母体、辛胺作为疏水基团的还原敏感型氨基酸阳离子脂质3-4a、3-4b、3-4c和3-6a。通过凝胶电泳、粒径、zeta电位、细胞毒性和体外转染等实验研究了他们的DNA结合能力和转染活性。结果显示:3-4b和3-4c具有较3-4a和3-6a更好DNA结合能力和转染效率。四种荧光脂质的细胞毒性与商品化试剂Lipofectamine 2000和25 KDa PEI相当,但其转染效率却低于商品化试剂,我们推测可能是疏水链长太短的原因。因此,为了进一步提高转染效率,我们对疏水基团进行了进一步改造。基于前期实验结果即以高电荷密度的精氨酸(如3-4b)作为亲水头部的脂质具有更好的结合DNA能力和较高的转染效率,因此,我们基于精氨酸亲水头部,设计合成了疏水尾部为十八胺、油胺和α-生育酚的还原响应型阳离子脂质3-4d、3-4e和3-4f,并通过考察了该系列阳离子脂质的结构活性关系。

关键词：基因载体刺激响应转染活性合成

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基因工程

生物技术通报 1989年第8期5卷 28-39页

892382 动物细胞的遗传转化[专,德]/DD-256-148∶21.09.87-DD-294564(27.04.88)21.09.87 as 294564.88-257913/37(8页)[译自 DBA,1988,7(25),88-11713]制备用于动物细胞转化的 DNA

关键词：编码区融合蛋白遗传转化序列分析启动子细胞转化读码框读框转染活性操纵子

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以组蛋白为核心的基因转染

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