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猪流行性腹泻病毒转录调控序列的转录效率评价及其在S蛋白表达中的初步应用

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猪流行性腹泻病毒转录调控序列的转录效率评价及其在S蛋白表达中...

作者：张雪南京农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属,是一种单股正链RNA病毒,其基因组大小约28 kb。该病毒能够引起新生仔猪发生急性腹泻、呕吐和脱水,具有高度传染性,仔猪死亡率高,对养殖业造成重大的经济损失。转录调控序... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属,是一种单股正链RNA病毒,其基因组大小约28 kb。该病毒能够引起新生仔猪发生急性腹泻、呕吐和脱水,具有高度传染性,仔猪死亡率高,对养殖业造成重大的经济损失。转录调控序列(TRS)是一种短的、富含AU的约10个核苷酸的基序,包括病毒基因组的前导序列(Leader)和下游编码体(Body)TRS。Leader TRS是位于冠状病毒基因组5′UTR序列高度保守的基序,而Body TRS存在于每个结构基因前,且每个基因结构开放阅读框(ORF)的Body TRS数量和起始密码子上游的位点在长度和序列上均不同。这两种TRS在冠状病毒的不连续转录过程中发挥重要的作用。有研究表明外源基因可以作为一个单独的转录单位在TRS的控制下进行转录和表达。但是目前还未有研究阐明PEDV不同TRS的转录调控效率有何不同。本试验旨在评价PEDV不同TRS的转录效率,并进行初步应用,将S基因的TRS置换为M基因的TRS,进而检测S蛋白的表达,为PEDV抗病毒疫苗的研究提供新思路。***转录调控序列转录调控效果的评价为了研究转录调控序列(TRS)在PEDV蛋白表达和病毒复制调控中的作用,在实验室构建好的PEDV感染性克隆的基础上,利用CRISPR/Cas9技术,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因插入PEDV基因组的N基因和3′UTR之间,成功构建5个重组质粒,转染易感细胞Vero后,拯救出一系列重组病毒,借以分析在不同TRS调控下的EGFP基因表达。研究结果表明,PEDV的所有结构蛋白和辅助蛋白的TRS均在不同水平上正向调控EGFP的表达,其中M蛋白的TRS调控的EGFP基因的表达量最高。而且本研究发现外源基因可以插入PEDV的N基因和3′UTR之间,并且EGFP的插入对PEDV的复制没有影响。本研究为PEDV下一代疫苗的合理设计和PEDV作为表达载体的应用提供了重要信息。***高效转录调控序列在S蛋白表达中的初步应用PEDV的S蛋白是位于病毒表面的刺突蛋白,含有中和表位和多个抗原表位,可诱导宿主产生中和抗体,在病毒入侵宿主细胞时发挥重要作用。前期研究证明M基因的TRS转录效率最强,而S基因的TRS转录效率最弱。为研究TRS-S置换为TRS-M能否使S基因的转录水平提高,进而增强S蛋白的表达。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将PEDV的TRS-S置换为TRS-M,成功构建含TRS突变的两个质粒,转染细胞后成功拯救出两种TRS-S突变的重组病毒r12-TRS1、r12-TRS2。空斑实验和生长曲线实验结果表明置换S基因的TRS对PEDV的复制能力没有显著影响。Western blot、IFA和绝对荧光定量PCR实验结果表明将S蛋白的TRS置换为转录效率最强的TRS-M,同时将TRS-S和TRS-S与S基因之间的碱基置换成TRS-M及TRS-M与M基因之间的碱基,能够有效促进PEDV S蛋白的表达。增强S蛋白的表达有助于提高PEDV候选疫苗的免疫原性,为PEDV疫苗研发提供新思路。

关键词： PEDV 转录调控序列反向遗传系统 S蛋白

基于转录调控序列重布策略设计猪繁殖与呼吸综合征病毒抗重组疫苗的研究

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基于转录调控序列重布策略设计猪繁殖与呼吸综合征病毒抗重组疫苗...

作者：陈金霞中国农业科学院

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种严重的接触性传染病,能够引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难的症状,又被称为“蓝耳病”。其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and re... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种严重的接触性传染病,能够引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难的症状,又被称为“蓝耳病”。其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）,PRRSV套式病毒目成员之一,属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。病毒基因组为单股正链RNA。自1996年于我国首次报道以来,该病的防控局面依旧相当严峻,其重要原因之一就是其病毒基因组在不断地发生RNA重组,出现多株新毒株,导致我国养猪业发生了巨大的经济损失,该病的防控也面临巨大的挑战。与大多数的套式病毒相似,PRRSV也通过非连续性转录方式来合成亚基因组。在此步骤中,转录调控序列（Transcriptional regulatory sequences,TRS）分布于PRRSV基因组的不同位置,如同一个“电力的线路”（circuit）中的元件,发挥重要的调控作用。在模板交换型（template switching）RNA重组机制中,TRS中的核心序列（Core Sequences,CS）也参与其中。根据TRS与基因组发生模板交换重组的相关联系,以及本实验室对PRRSV弱毒疫苗株Hu N4-F112基因组的TRS核心序列的鉴定和功能解析的基础。本研究在不影响病毒基因组氨基酸编码的前提下,对Hu N4-F112疫苗株基因组中TRS circuit中的Leader TRS和body TRSs的核心寡核苷酸中的关键保守碱基对“CC”进行突变,,构建并拯救得到一株基因组中所有TRS的核心碱基对与自然存在的均不相同的突变病毒。以此TRS突变病毒研发的弱毒疫苗候选株一旦与自然环境中的流行毒株发生模板交换型重组,那么产生的重组子代病毒的TRS碱基互补配对就会被破坏,从而导致子代重组病毒的非连续性转录过程被破坏,严重影响重组子代病毒的复制转录过程,将其引入一个致死性遗传陷阱,从而能够达到降低疫苗株与流行毒株发生重组的概率。本研究中,将成功构建并拯救得到的TRS circuit重布（TRS circuit rewiring）的突变病毒与亲本病毒进行了病毒生长特性的比较。在间接免疫荧光试验以及空斑形态比较试验中,发现该TRS circuit重布的突变病毒v A-TRSall株与亲本病毒Hu N4-F112株无显著性差异,能够有效地表达其结构蛋白N蛋白与非结构蛋白Nsp2。在病毒多步生长曲线比较中,发现v A-TRSall能够比亲本病毒更早更快地达到第一个复制高峰,在感染后48 h～96 h,v A-TRSall与亲本病毒Hu N4-F112均处于平台期,都在96 h,108 h出现病毒滴度降低并趋于稳定。随后,对v A-TRSall弱毒突变株的免疫保护效力进行了评价,检测发现弱毒疫苗候选株v A-TRSall在免疫后21天,PRRSV抗体水平上升至阳性水平,进行HP-PRRSV攻毒后一周,PRRSV抗体滴度达到峰值,之后的14天,抗体水平保持稳定。同时病毒血症检测显示,在攻毒14天降低至阴性指标以下。TRS circuit重布的PRRS弱毒突变株v A-TRSall对HP-PRRSV具有有效的免疫保护效力,是一株良好的弱毒疫苗候选株。为了评价TRS circuit rewiring的PRRS弱毒疫苗候选株的抗重组水平,分别进行了体外猪肺泡巨噬细胞（PAM）共感染和体内猪体共感染试验来进行检测评价。结果发现:根据发生突变,产生有利于发生重组的突变断点,进行了检测统计。在试验组v A-TRSall与NADC30-like株ZJqz21共感染组和对照组Hu N4-F112与ZJqz21共感染组分别挑取300个空斑病毒样本。对这些病毒的ORF3,ORF5基因的检测比较结果统计显示:试验组与对照组相比,产生的突变断点的形式与数量,都有所减少。说明TRS circuit重布的突变病毒能够极大的减少template switching形式的重组概率,符合预期。证明基于TRS circuit rewiring的抗重组疫苗候选株的设计是切实可行的。综上所述,本研究在PRRSV弱毒疫苗株Hu N4-F112的感染性克隆平台上,运用反向遗传操作技术,构建并拯救得到一株TRS circuit rewiring的PRRS弱毒疫苗候选株v A-TRSall。对v A-TRSall株进行了病毒生物学特性分析,证明了其与亲本疫苗株生长特性存在差异。证明了v A-TRSall株能够对HP-PRRSV起到有效的免疫保护力。同时也初步检测证明了该突变弱毒疫苗候选株能够有效降低与NADC30-like发生突变重组的概率。现有的实验结果也进

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列抗重组免疫效力弱毒疫苗株

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

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郑州大学学报（医学版） 2005年第3期40卷 473-476页

作者：罗威黄文广殷涛华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科武汉430022

目的:构建含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法:利用PCR技术从人乳癌细胞MCF7中扩增出DF3/MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3/MUC1启动子的转... 详细信息

目的:构建含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法:利用PCR技术从人乳癌细胞MCF7中扩增出DF3/MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3/MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pGL3-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3DF3DTA。结果:构建了含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论:重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。

关键词： DF3/MUC1 转录调控序列白喉毒素A链克隆重组质粒乳癌

猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列顺式作用元件的鉴定及其在基因转录表达中的机制解析

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作者：张宽中国农业科学院

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染引起的严重接触性传染病,可导致母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状,俗称“蓝耳病”（Blue-eared disease）。猪繁殖与呼吸综合征病毒属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。该病于20世纪90年代初首次被欧洲和美国报导,而我国于1996年首次报道了PRRS的出现,并且在2006年出现了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV）,2012年以来又陆续出现了NADC30-like PRRSV。目前PRRS已成为影响我国养猪业的一个重要问题。PRRSV采用非连续性转录的方式来进行亚基因组m RNA（Subgenomic m RNA,sg m RNA）的合成,病毒的转录调控序列（Transcription Regulatory Sequence,TRS）在这个过程中起着至关重要的作用。TRS分为病毒基因组的先导序列（Leader）和下游编码体（Body）的TRS。为了深入了解转录调控序列在病毒亚基因组转录和翻译过程中的作用,本研究首先对HP-PRRSV细胞传代致弱株Hu N4-F112和欧洲型LV株的Leader-Body结合位点进行详细鉴定与分析,分别鉴定了两种毒株Leader-TRS以及各个Body-TRS的序列及其在基因组中的相对位置,发现两种毒株的Body-TRS的核心寡核苷酸的序列和侧翼序列存在巨大差异,但是二者核心寡核苷酸的序列同源性较高,尤其是3?端两个碱基是一致的。本研究基于表达绿色荧光蛋白（EGFP）的Hu N4-F112-EGFP全长感染性克隆平台,构建了针对TRS6的一系列突变的全长c DNA克隆,并构建了将TRS6替换为其它Body-TRS的全长c DNA克隆。通过病毒拯救以及对病毒的生物学特性分析等发现,同时突变TRS6核心寡核苷酸3?端两个碱基的全长突变体克隆不能拯救出病毒;而单独缺失TRS6 5?端和3?端侧翼序列的全长突变体克隆可以拯救出病毒,但是侧翼序列缺失后拯救出的病毒相较于亲本病毒的滴度有所下降;5?端和3?端侧翼序列同时缺失的全长突变体克隆不能拯救出病毒。另一方面,将Hu N4-F112-EGFP的TRS6替换为TRS2,TRS3和TRS7之后,突变病毒能被拯救,并有相似的生长特性。但是其中替换为TRS2的重组病毒滴度相对较低;而将TRS6替换为TRS4和TRS5之后,则未能拯救出活病毒。通过对插入的不同的Body TRS区域的二级结构进行预测分析,结果发现TRS4和TRS5在插入位点区域与周边序列所形成的茎环结构,其核心寡核苷酸位于茎环结构的单链和茎结构上,这样的相对位置可能影响了TRS核心寡核苷酸与Leader-TRS的碱基互补配对的过程,进而影响了病毒的亚基因组转录,对病毒的拯救造成了阻碍,其具体的详细机制还需做进一步的研究。综上所述,本研究鉴定了两种不同PRRSV毒株的Leader-TRS和一系列Body-TRS的序列以及在基因组中的相对位置;证明了TRS cassette一级序列对于其调控作用的影响;同时也证明了ORF1b和ORF2a基因区中4种不同的Body-TRS cassette可以引导外源基因高效表达。该研究为进一步解析PRRSV转录调控元件和今后以PRRSV疫苗株为活病毒载体进行多价重组疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列非连续性转录外源基因表达反向遗传操作

组织特异性转录调控序列及在肿瘤基因治疗研究中的应用

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国外医学（免疫学分册） 1997年第3期20卷 113-117页

作者：马凌曹广文第二军医大学微生物学教研室

肿瘤特征性蛋白“持家基因”转录调控序列是肿瘤细胞内特异活化的基因调控序列，可使外源基因在肿瘤细胞中特征性地表达。本文综述了普通启动子及组织特异性启动子的基本结构与功能，转录调控因子对启动子的调节以及目前在肿瘤基因治疗... 详细信息

肿瘤特征性蛋白“持家基因”转录调控序列是肿瘤细胞内特异活化的基因调控序列，可使外源基因在肿瘤细胞中特征性地表达。本文综述了普通启动子及组织特异性启动子的基本结构与功能，转录调控因子对启动子的调节以及目前在肿瘤基因治疗研究领域中应用价值的人酪氨酸酶（Tyr）启动子，甲胎蛋白（AFP）启动子，癌胚抗原（CEA）启动子等的研究进展。

关键词：转录调控序列基因治疗肿瘤

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甲胎蛋白转录调控序列研究进展

胃肠病学和肝病学杂志 1997年第3期6卷 198-200页

作者：杨淑英段芳龄鲁凤民河南医科大学消化疾病研究所

甲胎蛋白转录调控序列位于甲胎蛋白５’端侧翼区，由启动子，增强子、沉寂子、糖皮质激素反应元件等组成。这些元件通过与反式作用因子作用特异性调控ＡＦＰ基因表达。利用这些特异性序列与外源基因连接，可调控外源基因在肝癌细胞特异... 详细信息

甲胎蛋白转录调控序列位于甲胎蛋白５’端侧翼区，由启动子，增强子、沉寂子、糖皮质激素反应元件等组成。这些元件通过与反式作用因子作用特异性调控ＡＦＰ基因表达。利用这些特异性序列与外源基因连接，可调控外源基因在肝癌细胞特异表达。

关键词：甲胎蛋白转录调控序列基因调控肝肿瘤

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转录调控序列与肝癌靶向基因治疗的研究进展

中华肝脏病杂志 2000年第6期8卷 380-381页

作者：崔俊杨冬华第一军医大学珠江医院消化科广州510282

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猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列顺式作用元件的鉴定及其在基...

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株作为外源基因表达活病毒载体的研究

中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会...

作者：张宽陈金霞张玉娇杜楠楠郑浩姜一峰李丽薇虞凌雪周艳君童武童光志高飞

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的转录调控序列(Transcription Regulatory Sequence,TRS)在sg mRNA的合成中起着至关重要的作用。为了深入了解TRS在病毒亚基因组转录和翻译过程中的作用,本研究通过对高致病性PRRSV细胞传代致弱株HuN... 详细信息

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的转录调控序列(Transcription Regulatory Sequence,TRS)在sg mRNA的合成中起着至关重要的作用。为了深入了解TRS在病毒亚基因组转录和翻译过程中的作用,本研究通过对高致病性PRRSV细胞传代致弱株HuN4-F112的转录调控序列进行鉴定,并构建了一系列针对TRS6突变以及将TRS6替换为其它Body-TRS的全长感染性克隆。结果表明,同时突变TRS6核心寡核苷酸3端两个碱基或同时缺失5'端和3'端侧翼序列的全长突变体克隆均不能拯救出病毒,而单独缺失TRS6 5'端或3'端侧翼序列的全长突变体克隆可以拯救出病毒,但侧翼序列缺失后拯救出的病毒相较于原始亲本病毒的滴度有所下降;将HuN4-F112-EGFP的TRS6替换为TRS2、3、7均可以拯救出病毒,并有相似的生长特性,但含有TRS2的重组病毒滴度相对较低,而将TRS6替换为TRS4或TRS5后,无法拯救出病毒。本研究鉴定了HuN4-F112的一系列TRS-Body在基因组中的相对位置,同时也证明了ORF1b和ORF2a基因区中4种不同的Body-TRS cassette都可以引导基因稳定高效的表达,该研究为今后以PRRSV疫苗株为活病毒载体进行多价重组疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列非连续性转录

来源： cnki会议评论

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中国动物传染病学报 2023年第3期31卷 12-19页

作者：陈金霞张宽张玉娇杜楠楠郑海红李丽薇周艳君虞凌雪童武郑浩童光志高飞中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

利用反向遗传操作技术,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也可以被用作外源基因表达的活载体。前期研究将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区,所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够... 详细信息

利用反向遗传操作技术,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也可以被用作外源基因表达的活载体。前期研究将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区,所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够在体外和体内高效表达E2蛋白。能够为猪瘟和HP-PRRS的感染提供100%的免疫保护。本研究利用rPRRSV-E2的全长感染性克隆平台,在PRRSV基因组ORF7和3'非翻译区之间插入了转录调控序列6(TRS6)和绿色荧光蛋白的编码基因,构建并拯救了重组病毒rPRRSV-E2-EGFP,该病毒感染MARC-145细胞后,可以同时表达猪瘟E2蛋白和EGFP。外源序列在载体中能够保持遗传稳定。本研究为开发PRRSV作为病毒活载体疫苗提供了一个新的外源基因插入位点和构建策略,对今后多价疫苗的研发有重要意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 3'非翻译区转录调控序列外源基因表达

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