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生物化学与生物物理进展 2010年第5期37卷 527-533页

作者：郑花鸯汤必奎王培伟高方健胡晓波龚立朱乃硕复旦大学生命科学学院微生物感染与分子免疫学实验室遗传学国家重点实验室生物医学研究院上海200433 蚌埠医学院生物科学系蚌埠233030

PD-1分子是一种重要的免疫调控因子,目前对其自身表达调控尚未有系统的研究.对PD-1启动子区域进行分析,克隆构建了含PD-1基因上游约2kb范围内含4种不同长度调控序列的双荧光素酶表达载体.通过FACS检测发现,小鼠T淋巴瘤EL4细胞稳定表达PD... 详细信息

PD-1分子是一种重要的免疫调控因子,目前对其自身表达调控尚未有系统的研究.对PD-1启动子区域进行分析,克隆构建了含PD-1基因上游约2kb范围内含4种不同长度调控序列的双荧光素酶表达载体.通过FACS检测发现,小鼠T淋巴瘤EL4细胞稳定表达PD-1,而骨髓瘤Sp2/0-Ag细胞则在佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和离子霉素(ionomycin,IO)诱导后才表达PD-1.4种双荧光素酶报告系统在上述两种细胞中检测PD-1启动子各区段活性显示,-227～+49bp区域含有PD-1核心启动子,上游-1127～-716bp含有较强正性调节元件,而在-1685～-1128bp、-715～-228bp两个区域含有负性调节元件,这种正负调控区交错的启动子活性现象说明了PD-1基因表达调控的复杂性,这些结果为PD-1基因的表达调控提供了结构基础和依据.

关键词： PD-1 启动子鉴定转录调控分析

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三七茉莉酸响应WRKY转录因子的分离与分析

三七茉莉酸响应WRKY转录因子的分离与分析

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作者：邱炳玲昆明理工大学

学位级别：硕士

三七[Panax notoginseng(Burk)***]又名田三七,具有活血化瘀、消肿定痛、止血补血、提高机体免疫力等功效,药用价值高。近年来根腐病、黑斑病、圆斑病等真菌病害严重影响了三七的品质及三七产业的可持续发展,其中主要由茄腐镰刀菌导致... 详细信息

三七[Panax notoginseng(Burk)***]又名田三七,具有活血化瘀、消肿定痛、止血补血、提高机体免疫力等功效,药用价值高。近年来根腐病、黑斑病、圆斑病等真菌病害严重影响了三七的品质及三七产业的可持续发展,其中主要由茄腐镰刀菌导致的三七根腐病最为严重。本课题组在前期研究中发现茉莉酸信号是三七响应茄腐镰刀菌的重要信号途径,并且从三七中分离得到一系列茉莉酸响应的抗病相关基因(PnDEFL1、PnSN1、PnPR10-3、PnChI1、PnGlu1、PnPGIP)。WRKY转录因子在调控植物防御病原菌侵染的转录重编程过程中发挥重要作用,是植物防御反应过程中的重要表达基因,近年来得到了广泛的研究关注,但对三七WRKY转录因子的研究却鲜见报道,且WRKY转录因子在三七体内是否参与调控对病原菌的防卫反应尚不清楚,因此,本项目从三七中分离协同茉莉酸信号参与茄腐镰刀菌防卫反应的WRKY基因;分析其在正常生长的三七中、信号分子处理后以及茄腐镰刀菌侵染过程中的表达谱;并选择了响应茉莉酸且表达水平较高的三七PnWRKY9基因,对其进行结构和亚细胞定位分析、功能验证以及对三七防御素基因PnDEFL1的转录调控特性研究。本论文的开展将有助于进一步了解三七WRKY转录因子协同茉莉酸信号参与对茄腐镰刀菌的防卫反应机制,深入认识三七与根腐病菌的分子互作机制。本文的研究内容和研究结果总结如下:1、通过转录组测序技术获得三七WRKY基因家族序列,并克隆得到30个具有完整ORF框的三七WRKY基因,将其命名为PnWRKY1-PnWRKY30。对这些基因进行保守结构分析、系统发育树分析、茉莉酸甲酯信号分子处理后茄腐镰刀菌侵染过程的表达谱分析。结果表明三七WRKY基因家族具有完整的保守结构域,在进化过程中高度同源。PnWRKY5/6/9/11/15/21/22/25/28/30等10个WRKY基因响应茉莉酸甲酯处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。2、选取响应表达水平较高的PnWRKY9基因进行深入的功能研究。序列分析发现该基因含有一个WRKY结构域和一个CTYQGCX23HTH锌指结构域;构建PnWRKY9与GFP的融合表达载体,将其转化至根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105感受态细胞中,在洋葱表皮细胞中瞬时表达,激光共聚焦显微镜下观察PnWRKY9蛋白的定位位置,结果表明PnWRKY9蛋白定位在细胞核中。构建了p CAMBIA2300s-PnWRKY9植物超表达载体转化至WT烟草中稳定表达,获得PnWRKY9转基因烟草,并进行抗性分析,结果表明PnWRKY9转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显提高。随后又构建了PnWRKY9的RNAi表达载体将其转化至三七叶片中瞬时表达,并接种茄腐镰刀菌,结果显示RNAi载体表达的三七叶片增强了对茄腐镰刀菌的敏感性。功能验证分析表明,PnWRKY9是三七应对茄腐镰刀菌侵染的正调控因子。3、为验证PnWRKY9是调控三七抗性相关基因的转录因子,克隆了三七防御素基因PnDEFL1的启动子PPnDEFL1。该启动子含有一个W-box,进而采用凝胶阻滞(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、酵母单杂交(yeast one hybrid,Y1H)分析PnWRKY9对PPnDEFL1的结合以及转录激活。构建了PnWRKY9的原核表达载体,通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导外源蛋白表达,并用Ni-NTA柱亲和层析法纯化出PnWRKY9重组蛋白,用于EMSA实验,结果显示PnWRKY9蛋白能与含有W-box的PPnDEFL1片段特异性结合;构建了PnWRKY9猎物载体和PPnDEFL1启动子诱饵载体,共同转化至酵母感受态细胞中用于YIH实验,结果表明,PnWRKY9转录因子具有转录激活特性;同时还构建了启动子与GUS基因表达融合载体,分别转化至过表达PnWRKY9的转基因烟草和WT烟草中表达,并测定转基因烟草的GUS活性,结果表明,PPnDEFL1与PnWRKY9共表达烟草的GUS活性明显强于PPnDEFL1单表达转基因烟草的GUS活性。可见PnWRKY9转录因子能转录激活PnDEFL1基因的启动子,正调控PnDEFL1的表达水平。三七WRKY是协同茉莉酸信号途径参与对茄腐镰刀菌防卫反应的重要转录因子基因,其中有10个基因响应茉莉酸甲酯的处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。PnWRKY9是细胞核定位蛋白,特异结合根腐病抗病基因PnDEFL1的启动子序列,并正调控PnDEFL1的转录水平。PnWRKY9响应茉莉酸信号,正调节防御素基因的表达,在三七对茄腐镰刀菌防卫反应中起重要的调控作用。

关键词：三七 WRKY转录因子茉莉酸茄腐镰刀菌表达特性分析功能分析转录调控分析

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玉米体细胞胚胎发生的转录组分析及相关基因克隆

玉米体细胞胚胎发生的转录组分析及相关基因克隆

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作者：丁美琪吉林大学

学位级别：硕士

随着对玉米需求量和品质要求的不断提升,快速有效地创制优良玉米新种质已经成为玉米分子育种的重要任务。植物组织培养与基因工程技术在转基因育种中的应用有效地促进了植物分子育种的发展。然而,植物组织再生培养有着明显的基因型依赖... 详细信息

随着对玉米需求量和品质要求的不断提升,快速有效地创制优良玉米新种质已经成为玉米分子育种的重要任务。植物组织培养与基因工程技术在转基因育种中的应用有效地促进了植物分子育种的发展。然而,植物组织再生培养有着明显的基因型依赖性特征,这也限制了玉米转基因育种的快速发展。本实验室从200份玉米骨干自交系中筛选出遗传转化效率高的玉米自交系Y423,Y423有着高体胚诱导率特征,在没有外源激素的分化培养基中能够同时分化出根和芽,形成完整的植株,且移栽成活率高。为了探究玉米体胚发生过程中的细胞内源激素代谢调控以及复杂分子调控机制,本研究进行了体细胞胚胎发生的转录组分析及相关基因的克隆,为今后的玉米遗传转化及分子育种奠定理论基础。激素是体胚诱导过程中重要的调节因子。外源激素的施加会引起内源激素代谢水平的变化,从而诱导体细胞获得胚性能力,形成体胚。实验采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)对内源IAA、ABA以及CTK在体胚发生过程中的浓度水平进行测定。结果表明在外源激素2,4-D的刺激下,细胞内激素水平发生显著变化,而各种激素间的相互平衡使得细胞脱分化最终形成体细胞胚胎。为了解玉米体细胞胚胎发生的分子机制,实验利用RNA-seq技术对来自玉米自交系Y423的幼胚(IE)、胚性愈伤组织(EC)、体细胞胚胎(SE)进行转录组分析。两个差异表达数据库(IE-vs-EC、IE-vs-SE)中的差异表达基因(DEGs)分别为3844和7449个。比较胚性愈伤组织与体胚的基因表达水平时,发现了260个DEGs显著差异表达。通过层次聚类算法分析,将筛选后的6888个DEGs的基因聚类到8个表达模式组中。分析发现,体胚发生相关的一些基因主要聚类到E或F组中,这些基因在体胚诱导过程中大多呈现出上调表达。Gene Ontology(GO)注释与KEGG pathway分析表明,E和F组中的DEGs大多与激素信号转导、胁迫响应以及代谢有关。在差异表达的转录因子中,主要的一些转录因子家族与胁迫响应有关,参与了细胞分化、胚胎发生及胚胎成熟。一些激素生物合成、激素极性运输、信号转导、代谢相关基因参与了玉米体胚发生分子调控。利用q RT-PCR对9个候选基因在玉米体胚发生过程中的表达模式进行分析,结果表明这9个基因可能在玉米体胚发生过程中起到重要的正调控作用。利用RT-PCR技术成功克隆了5个体细胞胚胎发生相关的候选基因并构建了植物表达载体,分别为:Pro35S:BAK1:GFP、Pro35S:Zm LBD17:GFP、Pro35S:Zm MADS11:GFP、Pro35S:RTCS1:GFP和Pro35S:Zm LBD24:GFP。对这5个基因进行生物信息学与功能分析,推测这几个候选基因可能参与调控体胚发生。5个表达载体均通过农杆菌介导侵染了拟南芥,获得Zm MADS11、RTCS1 T1代阳性拟南芥植株。异位表达Zm MADS11基因促进拟南芥在没有外源激素的培养下根部产生自发愈伤组织。综上所述,本文对玉米体细胞胚胎发生过程中的内源激素浓度的动态变化进行了测定。利用转录组数据对玉米体胚发生相关的信号通路以及基因表达调控网络进行分析。同时对筛选的候选基因在体胚诱导过程中的表达模式进行分析。克隆了5个候选基因,并进行了功能验证。

关键词：玉米体细胞胚胎 RNA-seq 转录调控分析基因克隆

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