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褶纹冠蚌Cristaria plicata是我国重要的淡水贝类之一,可以育珠,其在养殖生产过程中易受细菌及各种微生物感染,从而导致疾病的发生,影响其育珠能力。因此,探究褶纹冠蚌的免疫功能对其健康状况及育珠能力有着十分重要的意义。Nrf2/ARE信号通路是可以抵御外源的感染或内源的氧化伤害,降低氧化应激和介导抗氧化的关键通路。过氧化物酶(Peroxiredoxins,Prx)是一类抗氧化酶,是Nrf2/ARE信号通路的下游靶基因之一。Prx是以硫氧还蛋白作为电子供体来清除过氧化物,并参与细胞对ROS的反应。Prx5可以定位于哺乳动物细胞中的线粒体、过氧化物酶体、细胞质和细胞核,它不仅可以保护细胞免受氧化应激和细胞凋亡,还可以延长寿命。该酶还可提供保护,防止线粒体或核DNA损伤。此外,Prx5还参与多个物种在微生物感染后的免疫反应。本文采用RACE PCR技术克隆了褶纹冠蚌Prx5(命名为Cp Prx5)的c DNA全长,获得Prx5 c DNA序列全长,其中含有两个保守的半胱氨酸残基(Cys78和Cys179);预测蛋白的理论分子量为20.69 KDa,理论等电点为8.97。Cp Prx5的氨基酸序列与其他物种的Prx5具有较高的相似性(52.33-59.6%),并且氨基酸序列中含有一个Pfam Ahp C＿TSA域,位于35-159 AA处。构建系统发育树将Prx5归为非典型的2 cys Prx。Cp Prx5在褶纹冠蚌的各个组织中都有分布,在肝胰腺中表达量最高、其次在鳃和肾脏中。LPS、PGN、Poly I:C刺激导致Cp Prx5在肝胰腺、鳃和肾脏中的表达上调。重组质粒DE3-PGEX-4T-1-Cp Prx5在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表现出对HO的抗性。羟基自由基破坏质粒DNA,导致超螺旋质粒从开环状态变化成缺失状态。随着Cp Prx5蛋白浓度的增加,质粒DNA的超螺旋形态受到保护。干扰keap1后Cp Prx5在肝胰腺和鳃中的表达均上调,干扰Nrf2后Cp Prx5在肝胰腺和鳃中的表达均下调。带有GST标签的Cp Prx5重组蛋白纯化后浓度为0.320 mg/m L。Cp Prx5大量定位于293T细胞核中,少量定位于细胞质中,Cp Maf K定位于细胞核中。GST-Pull down检测了Cp Maf K与Cp Prx5二者有体外结合效果。凝胶阻滞结果显示Cp Maf K/Cp Nrf2异源二聚体对Cp Prx5的启动子有着调控的作用。

关键词： Nrf2/ARE通路过氧化物酶5 转录因子mafk

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褶纹冠蚌Nrf2/mafk通路对GPx的调控作用

褶纹冠蚌Nrf2/Mafk通路对GPx的调控作用

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作者：朱珊珊南昌大学

学位级别：硕士

Keap1/Nrf2-ARE信号通路是保护细胞免受氧化损伤的内源性抗氧化通路。当水生生物面临环境毒物胁迫时,会触发Keap1/Nrf2-ARE信号通路产生反应。本文研究了Keap1/Nrf2-ARE信号通路中核心转录因子Nrf2与mafk之间的作用,以及他们对下游谷胱... 详细信息

Keap1/Nrf2-ARE信号通路是保护细胞免受氧化损伤的内源性抗氧化通路。当水生生物面临环境毒物胁迫时,会触发Keap1/Nrf2-ARE信号通路产生反应。本文研究了Keap1/Nrf2-ARE信号通路中核心转录因子Nrf2与mafk之间的作用,以及他们对下游谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的调控作用。微囊藻毒素刺激下,肝胰腺、鳃、肾中Cp mafk表达呈现上调趋势。在肝胰腺中,Cp mafk m RNA表达在12和72 h极显著上调;在鳃中,Cp mafk表达12和48 h显著上调;在肾中,Cp mafk表达72和96 h显著上调。经si RNA沉默Cp Nrf2和微囊藻毒素MC处理组与MC组相比,肝胰腺、鳃、肾中Cp mafk表达呈现下调趋势。其中肝胰腺中的变化最为明显。在肝胰腺中,Cp mafk m RNA表达在12、24、48、96 h极显著下调;在鳃中,Cp mafk表达48 h极显著下调,72和96h显著下调;在肾中,Cp mafk表达24 h极显著上调,96 h极显著下调。与NS组相比,注射ds Cp mafk的48 h,Cp mafk m RNA表达水平分别下降了45%。ODN1组在24 h Cp mafk m RNA表达水平下降了46%;ODN2组24和48 h出现干扰效果,Cp mafk m RNA表达水平分别下降了32%和49%,与ODNyx组对比,48 h有干扰效果;ODN3组24和48 h出现干扰效果,Cp mafk m RNA表达水平分别下降了41%和46.8%,与ODNyx组对比Cp mafk m RNA表达水平都有显著的下降;ODN4组24和48 h出现干扰效果,Cp mafk m RNA表达水平分别下降了60%和32%,与ODNyx组对比,Cp mafk m RNA表达在24 h水平显著下降;ODN5组24和48 h出现干扰效果,Cp mafk m RNA表达水平分别下降了45%和44%,与ODNyx组对比Cp mafk m RNA表达水平都有显著的下降。在不同干扰情况下,与NS组相比,Cp mafk干扰效果为41%和46.8%时,Cp Nrf2m RNA表达极显著下降,Cp mafk干扰效果为60%时,Cp Nrf2 m RNA表达显著下降;与ODNyx组相比,Cp mafk干扰效果为46.8%时,Cp Nrf2 m RNA表达下降极显著。与NS组相比,Cp GPx m RNA表达出现极显著下调;与ODNyx组相比,Cp mafk干扰效果为41%和60%时,Cp GPx m RNA表达分别出现显著下调和极显著下调。褶纹冠蚌中Nrf2的缺乏会影响mafk的转录水平,褶纹冠蚌的mafk缺乏,同样会引起Nrf2转录水平下降。结果证明褶纹冠蚌的Nrf2和mafk两个转录因子之间存在直接或间接的调控关系。原核表达GST-Cp Nrf2蛋白,蛋白质沉降技术与质谱联用显示GST-Cp Nrf2蛋白能与褶纹冠蚌组织蛋白中的mafk蛋白结合,酵母双杂实验,进一步验证褶纹冠蚌Nrf2与mafk之间存在直接作用关系。褶纹冠蚌GPx的启动子序列全长为1974 bp,预测显示Cp GPx启动子序列具有三个TATA-box,三个CAAT-box,含有多种转录因子结合位点,包括Nrf2、Ap-1、c-Myc、NF-kappa B、Smad3、Smad4、ARE元件等。凝胶阻滞显示,GST-Cp Nrf2蛋白无法与Cp GPx的启动子在体外结合。双荧光素酶报告基因实验表明Cp Nrf2和Cp mafk对Cp GPx的启动子为负向调控。

关键词：褶纹冠蚌 Keap1/Nrf2-ARE信号通路转录因子mafk 谷胱甘肽过氧化物酶(GPx) 启动子

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