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Bdcncc/Bdmaf-K调控BdUGT301D2/429A1介导桔小实蝇对马拉硫磷抗性的分子机制

BdCncC/BdMaf-K调控BdUGT301D2/429A1介导桔小实蝇对马拉硫磷抗性...

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作者：陈梦玲西南大学

学位级别：硕士

桔小实蝇Bactrocera dorsalis是我国重要的农业害虫和外来入侵物种,由于化学农药长期的不合理使用及滥用,目前已对多种杀虫剂产生了不同程度的抗性。解毒代谢酶基因的过表达是昆虫对多种药剂形成代谢抗性的重要原因。UDP-葡萄糖基转移酶... 详细信息

桔小实蝇Bactrocera dorsalis是我国重要的农业害虫和外来入侵物种,由于化学农药长期的不合理使用及滥用,目前已对多种杀虫剂产生了不同程度的抗性。解毒代谢酶基因的过表达是昆虫对多种药剂形成代谢抗性的重要原因。UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase,UGTs)是昆虫代谢抗性中重要的次级代谢酶,但在桔小实蝇杀虫剂抗性中的功能及其转录调控机制尚不明确。因此,本学位论文采用室内使用马拉硫磷连续筛选获得的桔小实蝇抗性品系,通过生化毒理学分析确定UGTs是否参与桔小实蝇对马拉硫磷的抗性;在全基因组水平筛选鉴定UGTs基因,解析其家族分类、系统发生关系、染色体分布等信息,筛选出在抗性品系中过表达的重要UGTs基因;利用免疫组化、RNAi、三维结构模拟及分子对接、异源表达及HPLC技术,明确重要UGTs基因是否介导桔小实蝇对马拉硫磷的抗性;综合生物信息学预测及转录因子在抗性及敏感品系的表达差异分析,结合RNAi、双荧光素酶报告系统和ROS激活剂及抑制剂处理,揭示ROS激活通过转录因子通路调控重要UGTs基因在抗性品系过表达的分子机制。主要研究结果如下:1 UGTs介导桔小实蝇对马拉硫磷抗性的生化毒理学特性分析采用点滴法,对室内连续筛选的桔小实蝇马拉硫磷抗性品系及不接触药剂的敏感品系进行生物测定,结果显示马拉硫磷对桔小实蝇抗性品系和敏感品系的LD分别为5,915.84和95.09 ng/头,抗性倍数为62.21倍。分别使用UGTs专性抑制剂Sul和5-Nul对桔小实蝇抗性和敏感品系进行处理,然后用马拉硫磷进行生物测定,结果显示马拉硫磷对抗性品系的LD分别降低至1,778.42和1,453.79ng/头,增效比分别为3.33和4.07;敏感品系的LD分别为91.53和56.74 ng/头,其增效比分别为1.04和1.68。说明UGTs专性抑制剂对桔小实蝇抗性品系的增效作用明显,但对敏感品系无增效作用。同时,UGTs酶活力测定发现抗性品系的UGTs酶活力是敏感品系的3.72倍,说明UGTs酶活力的提升可能在桔小实蝇对马拉硫磷的代谢抗性中发挥作用。2桔小实蝇抗性和敏感品系间差异UGTs基因的鉴定基于桔小实蝇基因组数据库,共鉴定到31个UGTs基因,其中30个具有完整的开放阅读框。所有UGTs含有2个糖受体结合域,其中29个UGTs包含4个保守结构域及信号肽。系统发育分析表明,BdUGT301、BdUGT302、BdUGT35、BdUGT36、BdUGT37、BdUGT49、BdUGT50基因家族与果蝇UGTs基因聚为一支且亲缘关系最近;桔小实蝇BdUGT429家族的6个基因聚为一个分支,表现出一定程度的基因扩增。染色体定位发现,除BdUGT49D3外,其余30个基因均位于4条染色体上,并且BdUGT301、BdUGT302、BdUGT35和BdUGT429基因家族在同一染色体上分布紧密、位置接近且编码方向相同。利用RT-qPCR技术,分析UGTs基因在桔小实蝇抗性和敏感品系4日龄成虫的表达模式,结果显示BdUGT301D2、BdUGT35G1、BdUGT429A1、BdUGT429A3、BdUGT429B4、BdUGT442A1和BdUGT50B5在抗性品系中显著上调,暗示这些基因可能在桔小实蝇对马拉硫磷的抗性中发挥作用。分析两个品系成虫不同日龄UGTs基因的表达模式,发现BdUGT301D2和BdUGT429A1在抗性品系的成虫阶段均上调表达,暗示这两个UGTs基因在桔小实蝇的马拉硫磷代谢抗性中行使功能。3 BdUGT301D2和BdUGT429A1介导桔小实蝇对马拉硫磷抗性的功能解析利用RT-qPCR及免疫组化技术,分析发现BdUGT301D2和BdUGT429A1在桔小实蝇抗性品系的中肠和马氏管细胞的细胞膜及细胞器膜处大量分布,暗示UGTs可能参与有毒物质的跨膜转运进而行使对马拉硫磷的解毒功能;RNAi及Western Blot结果显示,BdUGT301D2和BdUGT429A1沉默效率达69.68%和57.55%,其蛋白含量也明显减少;两个基因分别沉默后的试虫对马拉硫磷的敏感性显著提升23.19%和20.42%。三维模拟及分子对接分析发现,BdUGT301D2和BdUGT429A1均存在与马拉硫磷正反异构体结合的空腔位点,推测两蛋白可以直接结合马拉硫磷;基于杆状病毒表达系统获得的重组蛋白与马拉硫磷共孵育后,马拉硫磷的含量分别显著减少47.54%和20.40%,表明两个UGTs重组蛋白可直接降解马拉硫磷;进一步的细胞毒力测定发现,表达两个UGTs蛋白的Sf9细胞对马拉硫磷耐受力分别显著提升,高达31.58%和31.13%,表明BdUGT301D2和BdUGT429A1有助于桔小实蝇对马拉硫磷的解毒。综

关键词：桔小实蝇马拉硫磷 UDP-葡萄糖基转移酶转录因子cncc/maf 活性氧

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