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微生物学报 2023年第11期63卷 4414-4429页

作者：刘佳宁吴洁五十岚泰夫罗锋常鹏西南大学资源环境学院能源生物资源开发重庆市重点实验室重庆400715

【目的】为齐整小核菌代谢工程研究建立高效的转录单元组装系统。【方法】通过应用Golden Gate技术,以mobius assembly为基础,分别设计并构建DNA元件标准化接口改造、单转录单元组装、应用质粒(多转录单元)组装等功能的载体,从而形成一... 详细信息

【目的】为齐整小核菌代谢工程研究建立高效的转录单元组装系统。【方法】通过应用Golden Gate技术,以mobius assembly为基础,分别设计并构建DNA元件标准化接口改造、单转录单元组装、应用质粒(多转录单元)组装等功能的载体,从而形成一套完整的多转录单元组装系统。【结果】构建了2个用于DNA元件标准化接口改造的Level 0载体,4个用于单转录单元组装的Level 1载体,4个用于应用质粒组装的Level 2载体和13个应用质粒组装的辅助质粒。然后应用此系统为齐整小核菌组装了若干经过标准化接口改造的DNA元件质粒、单转录单元质粒和硬葡聚糖相关基因的功能分析质粒。所构建的最终应用质粒可以同时适用于齐整小核菌的根癌农杆菌介导转化法、电穿孔转化法和原生质体转化法。【结论】此质粒系统具有强大的DNA设计、组装和容纳能力,为未来齐整小核菌代谢工程和功能基因组学研究提供了高效的质粒构建技术平台。

关键词：齐整小核菌 Golden Gate 转录单元 DNA组装

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利用Golden Gate “One-POT”技术组装运动发酵单胞菌转录单元

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应用与环境生物学报 2019年第1期25卷 170-175页

作者：杨依伟赵彩芳吴波秦晗何明雄农业部沼气科学研究所生物质能技术研究中心成都610041 四川农业大学小麦研究所成都611130 农业部农村可再生能源开发与利用重点实验室成都610041

为研究运动发酵单胞菌合成生物学及代谢工程,评估运动发酵单胞菌内源启动子及终止子,需要建立一种方便有效的多基因代谢途径组装方法.通过Golden Gate方法构建了一个含有运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶2编码基因启动子区(P_(adh2))、丙酮酸... 详细信息

为研究运动发酵单胞菌合成生物学及代谢工程,评估运动发酵单胞菌内源启动子及终止子,需要建立一种方便有效的多基因代谢途径组装方法.通过Golden Gate方法构建了一个含有运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶2编码基因启动子区(P_(adh2))、丙酮酸脱羧酶编码基因终止子区(T_(pdc))和绿色荧光蛋白开放阅读框(gfp)的人工转录单元.将含有IIS型限制内切酶Bbs I识别和酶切序列的特异性接头添加到P_(adh2)、T_(pdc)和gfp序列两侧,从而保证在一个反应体系中完成上述3个生物元件的酶切和连接,因此该技术被称作"One-POT".插入上述人工转录单元的穿梭质粒导入大肠杆菌和运动发酵单胞菌后可检测到发出绿色荧光的细胞.结果显示通过Golden Gate方法可有效组装转录单元所需DNA生物元件.本研究不仅可为运动发酵单胞菌合成生物学和代谢工程研究,尤其是设计多基因代谢途径组装方面提供技术工具,也可为评估运动发酵单胞菌内源启动子和终止子提供一种有效方法.

关键词：分子组装 Golden Gate 运动发酵单胞菌转录单元 IIS型限制内切酶

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柑橘溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri carAB转录单元的功能研究

柑橘溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri carAB转录单元的功...

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中国植物病理学会2015年学术年会

作者：卓涛柔伟范晓静 KAMAU Gicharu-Gibson 邹华松福建农林大学植物保护学院

氨甲酰磷酸合成酶（CPS）是由carA和carB的基因编码的2个亚基组成,负责精氨酸和嘧啶的生物合成。本研究鉴定Xanthomonas citri ***中carAB转录单元的基因构成,分析其生物学功能。运用RT-PCR方法鉴定carAB转录单元的全长,发现carAB转录... 详细信息

氨甲酰磷酸合成酶（CPS）是由carA和carB的基因编码的2个亚基组成,负责精氨酸和嘧啶的生物合成。本研究鉴定Xanthomonas citri ***中carAB转录单元的基因构成,分析其生物学功能。运用RT-PCR方法鉴定carAB转录单元的全长,发现carAB转录单元含有五个基因成员carA-orf-carB-greA-rpfE。对carA和carB基因进行突变分析,carB基因影响多种生物学表型,包括在寄主植物上的致病性、胞外水解酶活性、游动性和生物膜形成,而carA基因突变对细菌的生物学表型没有影响。将carAB转录单元启动子与报道基因GUS融合,氨甲酰磷酸合成酶催化的中间和终产物谷氨酸、嘧啶和精氨酸对启动子的活性都有抑制作用,负调控转录单元的表达。本研究为深入了解*** ***中carAB转录单元的生物学功能提供证据。

关键词： Xanthomonas citri subsp.citri 氨甲酰磷酸合成酶转录单元调控

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枯草芽胞杆菌MEP代谢路径基因簇分析及重组菌株构建

枯草芽胞杆菌MEP代谢路径基因簇分析及重组菌株构建

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作者：肖亚静黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一种理想的被广泛地应用于农业生产研究的对植物病原真菌具有拮抗作用的生防细菌。目前已明确,枯草芽胞杆菌中存在参与MEP代谢途径的相关基因及其编码蛋白的结构和功能,但参与MEP代谢途径的各个基因... 详细信息

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一种理想的被广泛地应用于农业生产研究的对植物病原真菌具有拮抗作用的生防细菌。目前已明确,枯草芽胞杆菌中存在参与MEP代谢途径的相关基因及其编码蛋白的结构和功能,但参与MEP代谢途径的各个基因的转录单元却鲜有研究,同时有关枯草芽胞杆菌是否可以通过转基因技术构建具备影响害虫天敌行为重组菌株的相关报道较少。本研究以枯草芽胞杆菌(***)916菌株为研究对象,旨在阐述参与MEP代谢途径相关基因的转录概况,并构建重组生防菌株,以影响害虫天敌的行为。利用生物信息学,以枯草芽胞杆菌Bs168为参考对象,结合KEGG和NCBI数据库分析Bs916菌株中参与MEP代谢途径和FPP合成的dxs,dxr,isp D,isp F,ip K,isp G,isp H,idi和isp A 9个基因在基因组中的分布情况,同时通过BLAST进行氨基酸相似性比对。结果表明这9个基因散布于Bs916菌株基因组中,其所编码的氨基酸与Bs168相应基因所编码氨基酸相似性均高于73%。通过测定Bs916在LB中的生长曲线,结合反转录PCR明确参与MEP代谢途径和FPP合成的9个基因的转录时期。结果表明:上述9个基因在菌株生长的指数期和稳定期都进行转录。以T4时期菌株为实验对象,利用RT-PCR确定9个基因的转录单元,同时通过5′RACE技术确定1-脱氧-5-磷酸-D-木酮糖合成酶(Dxs)的转录起始位点。结果发现:dxs与isp A共转录,与其它5个基因共同形成大小为6352 bp的多顺反子;dxr与其它19个基因共同形成大小为19355 bp的转录单元;isp D与isp F紧邻,中间间隔8 bp的核苷酸与其它20个基因共同形成大小为18580 bp的转录单元;idi与其下游的1个基因形成大小为3413 bp的转录单元;ip K与其它4个基因形成大小为2535 bp的转录单元;isp G与其上游的2个基因形成大小为2954 bp的转录单元;isp H与其下游的1个基因形成大小为819 bp的转录单元。Dxs的转录起始位点C位于编号为KO64S11240基因翻译起始密码子上游157 bp处。通过基因工程技术,构建具有影响害虫天敌行为的枯草芽胞杆菌菌株。结果表明:具有优化后编码橙花叔醇和香叶基芳樟醇合成酶的PITPS4基因在枯草芽胞杆菌916菌株具有转录活性。本研究明确了枯草芽胞杆菌916菌株MEP代谢途径相关基因的转录情况,为枯草芽胞杆菌MEP代谢路径相关基因的转录分析提供依据;同时初步完成含有PITPS4基因的重组菌株构建,为今后研制高效具有影响害虫天敌行为的枯草芽胞杆菌菌株奠定基础。

关键词：枯草芽胞杆菌 MEP代谢路径转录单元重组菌株

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