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细菌Ensifer adhaerens M78产胞外多糖对矿物风化的影响

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应用与环境生物学报 2023年第5期29卷 1226-1233页

作者：陈未高岩何琳燕盛下放江苏省农业科学院农业资源与环境研究所南京210014 农业农村部长江下游平原农业环境重点实验室南京210014 南京农业大学生命科学学院南京210095

研究微生物与矿物的相互作用机制对阐明土壤形成以及生物地球化学循环的规律和机理具有重要作用.以高效矿物风化细菌粘着剑菌(Ensifer adhaerens)M78为供试菌株,该菌株2 d溶出钾长石结构元素Al、Si分别达35.04±1.02μmol/L、57.99±4.8... 详细信息

研究微生物与矿物的相互作用机制对阐明土壤形成以及生物地球化学循环的规律和机理具有重要作用.以高效矿物风化细菌粘着剑菌(Ensifer adhaerens)M78为供试菌株,该菌株2 d溶出钾长石结构元素Al、Si分别达35.04±1.02μmol/L、57.99±4.82μmol/L,多糖产量在第4天达最高值819±12 mg/L.采用转座子插入突变技术,筛选到胞外多糖产量及矿物风化能力显著下降的突变株MT3、MT6、MT10,并采用红外光谱及染色体步移技术分析野生株与突变株的多糖结构及突变株插入位点.结果显示,菌株M78的胞外多糖呈酸性,含有丰富的—COOH、—NH_(2)官能团,突变株MT3、MT6胞外多糖结构与野生株有显著差异,菌株MT10胞外多糖结构与野生株相似;突变株失活的基因分别为染色体复制起始响应调节蛋白基因ctrA、多酚氧化酶基因yfiH和荚膜多糖转运酶基因kpsE.本研究表明菌株M78产生的胞外多糖显著促进了矿物风化,基因kpsE、ctrA、yfiH可能通过影响胞外多糖的合成与转运影响菌株矿物风化能力.

关键词：矿物风化胞外多糖转座子插入突变胞外多糖结构

蒺藜苜蓿中1个聚半乳糖醛酸酶基因突变体的筛选及共生固氮表型的初步鉴定

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华中农业大学学报 2017年第4期36卷 62-70页

作者：杨倩倩刘元陈大松李友国农业微生物学国家重点实验室/华中农业大学生命科学技术学院武汉430070

以模式豆科植物蒺藜苜蓿中1个聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因为对象,对其进行生物信息学分析,结果显示:该基因全长4 150bp,其编码区1 278bp,编码425个氨基酸;其编码蛋白包括2个与细胞壁主要成分果胶降解有关的保守结构域PL-6... 详细信息

以模式豆科植物蒺藜苜蓿中1个聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因为对象,对其进行生物信息学分析,结果显示:该基因全长4 150bp,其编码区1 278bp,编码425个氨基酸;其编码蛋白包括2个与细胞壁主要成分果胶降解有关的保守结构域PL-6superfamily和Glyco_hydro_28;该酶蛋白与鹰嘴豆、赤豆等豆科植物中的PG蛋白同源关系更近。苜蓿基因表达谱数据库分析和RT-PCR检测结果表明,MtPG在根瘤中呈显著增强表达,在非共生组织如根、叶中表达量很低。此外,基于该基因3个Tnt1转座子插入的目标候选突变体(NF0999、NF5561和NF4746)插入位点分析,得到1个纯合突变体材料NF4746,共生表型观察表明,MtPG基因在豆科植物共生固氮的早期侵染过程中发挥重要作用。

关键词：蒺藜苜蓿聚半乳糖醛酸酶基因 RT-PCR 转座子插入突变共生表型

应用pLG107质粒构建香蕉细菌性软腐病菌致病力减弱突变体库

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应用pLG107质粒构建香蕉细菌性软腐病菌致病力减弱突变体库

作者：陈梓桐华南农业大学

学位级别：硕士

香蕉细菌性软腐病由玉米狄克氏菌Dickeya zeae引起,扩散速度快,危害性大,近几年在我国香蕉产区造成严重的经济损失。目前,国内外对该病的研究多见于病原菌的培养性状、生理生化特性和防治方法,而与病原菌致病相关基因的功能分析未见报... 详细信息

香蕉细菌性软腐病由玉米狄克氏菌Dickeya zeae引起,扩散速度快,危害性大,近几年在我国香蕉产区造成严重的经济损失。目前,国内外对该病的研究多见于病原菌的培养性状、生理生化特性和防治方法,而与病原菌致病相关基因的功能分析未见报道。本研究以香蕉细菌性软腐病菌*** MS3为研究材料,利用转座子插入突变的方法,以致病性为筛选标记,构建致病力减弱突变体库,通过hiTAIL-PCR扩增获得目标基因未知序列,并利用基因敲除、功能互补等分子生物学手段进行目标基因功能验证,以期找到香蕉软腐菌的关键致病基因或致病调控基因,理清香蕉软腐病菌的致病机理,为探索病害防控提供新的作用靶标。主要研究结果如下:（1）构建转座子插入突变体库,以致病力为筛选标记筛选致病性减小的突变体,共获得1767个突变体菌株,经过多轮致病性测定获得145株致病力减弱的突变体。（2）对其中的11株经粉蕉苗接种确定致病性减弱的突变体进行hiTAIL-PCR扩增,结果发现:a、用T24转座子的3’端引物（LG107-0a/1a/2a）进行hiTAIL PCR扩增发现T24转座子3’末端会随机整合质粒其他位置的序列后进行插入突变,因此3’端引物不适合用于hiTAIL-PCR扩增;b、用T24转座子的5’端巢氏引物（LG107-0b/1b/2b）进行侧翼序列扩增,发现突变体M688的转座子插入在MS3的efeO（编码铁吸收组分）基因的第562 bp处;突变体M753的转座子插入在MS3的编码3-苯基丙酸转运蛋白（Phenylproprionate permease,PPP）的基因的第333 bp处;突变体M848的转座子插入在MS3的togM（编码寡聚半乳糖醛酸转运系统通透酶）基因的第17 bp处;突变体M853的转座子插入在MS3的着丝点蛋白（kinetochore protein）编码基因的第311 bp处。（3）对M848突变体的目的基因togM进行分析,发现该基因上游为果胶裂解酶基因pelW,下游为togN,togA和togB三个基因,基因TogMNAB共同组成一个ABC-type寡糖运输系统。qRT-PCR分析结果表明,T24转座子插入后,导致整个Tog寡糖运输系统基因表达明显下调;在野生型MS3背景下对该系统的两个通透酶编码基因togM和togN进行基因敲除,发现单敲除和双敲除突变体对粉蕉苗的致病力明显减弱,其涌动性（swarming）也较MS3有明显的减弱,对基因互补后致病性都基本恢复野生型水平。

关键词：香蕉细菌性软腐病转座子插入突变致病力高效热不对称交错PCR

镉抗性细菌Cupriavidus campinensis KQ46的分离鉴定及其镉抗性机制研究

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镉抗性细菌Cupriavidus campinensis KQ46的分离鉴定及其镉抗性机...

作者：朱宇辰南京农业大学

学位级别：硕士

随着经济发展,重金属镉污染的问题日益严重,不断威胁着生态环境和人类健康。微生物在镉污染修复和治理中具有巨大的应用价值,而微生物镉抗性的高低是其应用范围的一个决定性因素,研究微生物的镉抗性机制可以为微生物更好应用于镉污染治... 详细信息

随着经济发展,重金属镉污染的问题日益严重,不断威胁着生态环境和人类健康。微生物在镉污染修复和治理中具有巨大的应用价值,而微生物镉抗性的高低是其应用范围的一个决定性因素,研究微生物的镉抗性机制可以为微生物更好应用于镉污染治理与修复提供理论支持。从南京市栖霞山铅锌矿区的镉污染土壤及其附近生长的镉超富集植物龙葵中共分离到72株镉抗性细菌,其中34株分离自土壤,20株分离自龙葵根部,18株分离自龙葵茎。测定了菌株对镉的最大耐受浓度(MTC)和抗生素抗性,并对菌株的16SrDNA序列进行了测定和比对,发现菌株KQ46可以耐受的Cd2+浓度为4mM,对卡那霉素和庆大霉素敏感,确定以菌株KQ46为寻找镉抗性相关基因的出发菌株。结合形态学观察和生理生化实验,初步鉴定KQ46为Cupriavidus campinensis。以KQ46为供试菌株,利用mini-mariner转座子对其进行了随机插入突变,从5000个突变子中筛选到10株可以稳定生长且镉抗性能力降低突变株,镉耐受浓度分别由4mM降低到0.8-1.0mM。利用SEFA PCR方法扩增了每个突变株中转座子的侧翼序列,通过同源性比对分析,发现有6株突变株的转座子插入的基因分别与aroG、ppd、alkK、ppc、细胞色素c533合成基因以及Acyl-CoA转移酶基因高度同源,这6个基因均为基础生长代谢所需要的基因;其余4株突变株中转座子插入失活的基因分别可能为：hmp,与细胞抗逆性反应相关;hmyF,为重金属离子外排的辅助蛋白;组氨酸激酶基因,与细胞信号转导有关;fcuA,铁色素-铁离子复合物的受体蛋白。参考前人的研究结果后,认为fcuA可能与胞内Cd2+浓度调节有关,通过sau3Al随机酶切建库的方法获得了KQ46中fcuA基因的全序列(GenBank Accession No. KC776916)及其部分侧翼序列,构建了MT21的fcuA基因回补菌株DRfcuA。通过测定培养过程中菌株KQ46胞内Cd2+含量和培养基中Cd2+浓度并结合红外光谱分析,发现胞内和胞外Cd2+浓度在培养过程中基本维持恒定,培养12h和24h胞内镉含量分别为0.548±0.016mg/g和0.552±0.008mg/g,进入衰亡期后细胞对Cd2+吸收增多,含量为1.038±0.046mg/g,而红外光谱分析显示细胞表面并没有明显吸附有Cd2+,由此认为菌株KQ46主要依靠外排Cd2+来维持胞内Cd2+含量处于可耐受范围,从而产生镉抗性。同时对MT21和DRfcuA研究后发现虽然MT21和DRfcuA对镉的最大耐受浓度均为0.8mM,但在含有0.5mM Cd2+的培养条件下从扫描电镜照片可以看出0.5mM Cd2+对MT21毒害作用比DRfcuA明显,DRfcuA吸收的Cd2+仅为MT21的50%左右,不过仍然显著高于KQ46的吸收量,同时红外光谱分析显示在含有0.5mM Cd2+的培养条件下MT21和DRfcuA的细胞在1735cm-1处具有红外吸收峰,推测可能为细胞表面的酮、醛、酯类中的C=O键与Cd2+结合所致。由此分析认为fcuA基因在Cupriavidus campinensis KQ46中具有调控胞内Cd2+含量的功能,但仍需要其上下游基因的共同作用,其具体作用机制还有待进一步研究。

关键词：镉抗性机制转座子插入突变基因克隆 fcuA Cupriavidus campinensis

突变株N7-W13降解尼古丁调节因子的克隆和功能鉴定

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突变株N7-W13降解尼古丁调节因子的克隆和功能鉴定

作者：刘猛浙江工业大学

学位级别：硕士

随烟草废弃物大量进入环境的尼古丁对环境造成了污染,利用微生物方法将环境中的尼古丁去除或者资源化已备受关注。在分子水平上研究尼古丁的微生物降解机制也为其实际应用提供了理论基础和依据。Shinella ***7是本实验室已经获得的一株... 详细信息

随烟草废弃物大量进入环境的尼古丁对环境造成了污染,利用微生物方法将环境中的尼古丁去除或者资源化已备受关注。在分子水平上研究尼古丁的微生物降解机制也为其实际应用提供了理论基础和依据。Shinella ***7是本实验室已经获得的一株对尼古丁有高效降解能力的菌株,并且已明确其降解途径为吡啶和吡咯烷交叉途径。本文在此基础上,利用生物分子学方法对Shinella ***7降解尼古丁的代谢机理进行了更进一步的探究,在基因水平上对降解机制进行了完善。我们通过转座子插入突变的方法对Shinella ***7进行基因突变,然后通过影印平板的方法筛选出突变成功的目标失活突变株,共筛选到323株失活突变株,从而构建了一个降解尼古丁失活突变株文库。我们从文库中挑选出一株具代表性的突变株N7-W13进行研究,该突变株失活的是降解途径中尼古丁到6HN[6-羟基尼古丁(6-hydroxy-nicotine,6HN)]这一过程的基因。然后利用SEFA-PCR(Self-formed adaptor PCR)法克隆出突变株N7-W13的两个突变基因orfw13-1和orfw13-2。最后对这两个基因进行基因敲除以及同源功能互补获得互补菌株,验证了基因orfw13-1和orfw13-2是Shinella ***7将尼古丁代谢为6HN的必须基因。但是GenBank中分别对这两个基因序列的同源性比较结果表明,这两个基因和其他基因序列的同源性很低,可以判定基因orfw13-1和orfw13-2只是相关基因,而非功能基因,其调控功能类似于双组分调节系统(TCS)。

关键词： Shinella sp.HZN7 尼古丁转座子插入突变 SEFA-PCR法基因敲除同源互补

华癸根瘤菌MCHK-3535基因和苜蓿聚半乳糖醛酸酶基因MtPG在共生固氮中的功能研究

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华癸根瘤菌MCHK-3535基因和苜蓿聚半乳糖醛酸酶基因MtPG在共生固...

作者：于艳霞华中农业大学

学位级别：硕士

华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R能与宿主豆科植物紫云英建立共生固氮关系。本室前期转录组测序发现,*** 7653R中MCHK-3535在共生条件下表达量显著升高。本文对MCHK-3535在共生固氮中的生物学功能及潜在作用机制进行了研... 详细信息

华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R能与宿主豆科植物紫云英建立共生固氮关系。本室前期转录组测序发现,*** 7653R中MCHK-3535在共生条件下表达量显著升高。本文对MCHK-3535在共生固氮中的生物学功能及潜在作用机制进行了研究,取得了如下主要结果和发现。1、利用生物信息学方法,预测和分析了MCHK-3535的结构及功能。该基因全长1542 bp,编码513个氨基酸;含有三个功能结构域,包括HD-GYP、HTH-Lux R及DUF3391结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析发现该蛋白在中慢生根瘤菌中较保守,且与百脉根根瘤菌同源关系更近。2、q RT-PCR方法检测MCHK-3535在自生及共生条件下的表达特性,结果表明,MCHK-3535主要在共生固氮时期表达。进一步,构建Promoter-GUS融合表达载体,对MCHK-3535进行组织表达定位分析。结果表明该基因在早期侵染过程不表达,在根瘤侵染区、过渡期、固氮区表达,表达持续整个固氮期,这与q RT-PCR结果相一致,表明该基因主要参与根瘤发育和固氮。3、构建了MCHK-3535插入失活突变体(Δ3535)、超表达(OV3535)及互补菌株(C3535),检测各菌株在自生及共生条件下的表型。在自生条件下,Δ3535的生长速率较快,运动性降低,生物膜形成增加;共生条件下,MCHK-3535的失活显著提高紫云英固氮酶活和地上部分鲜重。4、经H2O2和Na Cl O氧化处理后,MCHK-3535表达量极显著升高,表明MCHK-3535可能作为转录调控因子,驱动细菌抗氧化生长。5、诱导表达MCHK-3535蛋白,HPLC测定酶活性,结果表明MCHK-3535作为磷酸二酯酶,可部分降解c-di-GMP。以上结果表明,MCHK-3535在自生及与紫云英共生过程中发挥重要功能,参与根瘤的正常发育并负向调控固氮酶活性。聚半乳糖醛酸酶基因(Polygalacturonase,PG)普遍存在于高等植物细胞中,对植物的生长发育至关重要。前期工作中,本室根据苜蓿基因表达谱数据库分析和q RT-PCR实验结果,发现Mt PG主要在根瘤中表达,而在其它非共生组织如根、茎、叶中表达量很少;此外,筛选到该基因Tnt1转座子插入突变体NF4746,初步观察纯合突变体共生表型。本研究以豆科植物蒺藜苜蓿一个Mt PG(Medtr6g005630)为研究对象,在前期工作基础上,进一步确证该基因在豆科植物共生固氮中的功能,探究其潜在作用机制。本文测定了植株长势、测定固氮酶活等共生表型。结果表明,与野生型R108相比,突变体植株NF4746的固氮酶活显著性降低、根瘤数量及重量均有不同程度的变化;构建了该基因Mt PG启动子-GUS融合表达载体,检测Mt PG基因的组织表达定位。结果表明,Mt PG可在根尖表达、在根瘤菌侵染早期可表达,在根瘤中表达量最高;统计早期侵染事件的变化,结果表明,与野生型R108相比,突变体NF4746的根毛弯曲、侵染线及根瘤原基均有显著性差异。q RT-PCR检测NIN、Lb、PR10、SOS2及IAA基因的表达量,结果表明,突变体NF4746中以上五个基因表达量均显著性降低。综合以上结果,分析认为Mt PG基因可能通过降解细胞壁、协助根瘤菌进入根毛、促进侵染线的形成及根瘤菌释放,从而参与共生固氮早期侵染过程并促进根瘤的成熟发育。

关键词：生物固氮 c-di-GMP 华癸根瘤菌7653R 共生表型时空表达蒺藜苜蓿聚半乳糖醛酸转座子插入突变早期侵染

施氏假单胞菌TS44多聚磷酸盐外切酶(PPX)的锑抗性功能研究

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施氏假单胞菌TS44多聚磷酸盐外切酶(PPX)的锑抗性功能研究

作者：龚靖华中农业大学

学位级别：硕士

锑(Sb)作为一种自然界普遍存在的剧毒重金属,以微量的含量广泛分布于土壤,江河,大气等自然环境中,具有重要的工业用途。随着工业开采的日趋加剧,大量的矿产资源被开发利用,伴随而来的锑污染越发严重。作为剧毒污染物,微量锑中毒即会导... 详细信息

锑(Sb)作为一种自然界普遍存在的剧毒重金属,以微量的含量广泛分布于土壤,江河,大气等自然环境中,具有重要的工业用途。随着工业开采的日趋加剧,大量的矿产资源被开发利用,伴随而来的锑污染越发严重。作为剧毒污染物,微量锑中毒即会导致严重身体不适,甚至器官衰竭死亡。然而某些微生物可以在极高锑浓度下生长,在锑的地球生态循环中起着重要的作用。但目前关于Sb(Ⅲ)抗性菌和Sb(Ⅲ)氧化菌的发现鲜有报道,分子机制更是少有研究。为了揭开Sb(Ⅲ)抗性菌的神秘面纱,探究其抗性机理,本课题利用一株具有高Sb(Ⅲ)抗性和氧化表型的施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri TS44为实验材料,对其锑抗性相关基因进行分离鉴定和功能研究。本课题通过Tn5转座子插入突变方法,构建TS44突变体库,获得转化子3000个,经过反复筛选后获得3株锑抗性下降突变子,并成功分离出突变子的侧翼序列,依次为多聚磷酸盐外切酶基因(ppx)、细胞色素氧化酶亚基编码基因、孤儿组氨酸蛋白激酶(QseC/QseB)基因。由于之前已有相关文献猜测ppx基因可能参与铜离子的外排途径,因而本课题重点探究ppx基因对TS44锑抗性的潜在贡献作用。ppx基因编码多聚磷酸盐外切酶,可依次连续切断多聚磷酸盐最末端高能磷酸键,释放磷离子和大量能量。本实验通过基因敲除、互补以及荧光定量PCR等方法对ppx基因进行了深入探究,研究结果表明,TS44Δppx突变体的锑抗性明显下降,而互补菌株的锑抗性基本恢复,对数生长早期突变株体内锑浓度多于野生型3倍,荧光定量PCR结果显示ppx基因受锑诱导表达,且细菌体内多聚磷酸盐含量在加锑条件下降低。以上结果表明,ppx基因对Sb(Ⅲ)的外排具有重大贡献作用,其作用机理可能为：Sb(Ⅲ)通过甘油水孔蛋白等转运蛋白进入细胞质后,诱导ppx基因表达量上调且多聚磷酸盐外切酶酶活升高,从而水解多聚磷酸盐释放大量磷残基及能量供机体代谢,胞内大量磷残基与胞外氢离子形成跨膜质子梯度通道,Sb(Ⅲ)被磷残基携带而运出体外,最终减少了Sb(Ⅲ)对菌体的毒害作用。此外,为了更加深入了解Sb(Ⅲ)的外排途径,本研究曾对部分表达上调幅度较大的耐药小节细胞分裂家族(RND)外排基因进行功能缺失突变,发现突变株的锑抗性表型没有明显变化,说明Sb(Ⅲ)的外排过程并未受到明显抑制,猜测Sb(Ⅲ)的外排过程是由多基因共同协调表达完成的复杂代谢过程,因而需进一步分析验证。本研究对菌株TS44的锑抗性机理进行了简要阐述,并首次证实了ppx基因对Sb(Ⅲ)抗性具有重大影响,对后续微生物的锑代谢机理研究具有重要借鉴价值。

关键词：锑转座子插入突变多聚磷酸盐多聚磷酸盐外切酶 Sb(Ⅲ)外排施氏假单胞菌

DGDG合成酶基因MtDGD1和聚半乳糖醛酸酶基因MtPG在蒺藜苜蓿共生固氮中的功能研究

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DGDG合成酶基因MtDGD1和聚半乳糖醛酸酶基因MtPG在蒺藜苜蓿共生固...

作者：杨倩倩华中农业大学

学位级别：硕士

双半乳糖甘油二脂(digalactosyl diacylglycerol,DGDG)是广泛存在于高等植物叶绿体和蓝藻中的一类半乳糖脂,作为类囊体膜的主要组成成分之一,DGDG对于植物光合作用功能的发挥以及植物的生长发育具有重大意义。而在豆科植物中,DGDG也在... 详细信息

双半乳糖甘油二脂(digalactosyl diacylglycerol,DGDG)是广泛存在于高等植物叶绿体和蓝藻中的一类半乳糖脂,作为类囊体膜的主要组成成分之一,DGDG对于植物光合作用功能的发挥以及植物的生长发育具有重大意义。而在豆科植物中,DGDG也在其根瘤共生体膜上存在。DGD1是DGDG的主要合成酶之一。在前期工作中,已克隆到该基因的全长,通过免疫荧光和免疫电镜发现Mt DGD1定位于根瘤中含菌细胞的共生体膜上,构建了该基因沉默和超表达载体。本研究以豆科模式植物蒺藜苜蓿A17的双半乳糖甘油二脂合成酶基因(Mt DGD1)为对象,在前期已有的工作基础上,对该基因在豆科植物共生固氮中的功能机制进行进一步探究。主要研究内容和结果如下:1.通过生物信息学网站分析、获取、克隆Mt DGD1启动子序列,构建了启动子-GUS融合载体,进行了组织表达定位观察。通过苜蓿基因表达谱网站及转录组分析,利用Realime PCR检测了Mt DGD1的时空表达和组织特异性表达,确证该基因与共生固氮作用密切相关。2.通过植株长势、根瘤切片的光学显微镜和透射电子显微镜观察、根瘤固氮酶活测定以及根瘤中DGDG脂质丰度的测定等多个指标,检测和考察了Mt DGD1沉默及超表达后转基因植株的共生表型,阐明了该基因在共生固氮中的作用;3.通过Realime PCR和LC-MS分别检测了低磷条件下Mt DGD1的转录水平,DGDG及磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)等脂质丰度的变化,初步明确该基因在根瘤发育过程中的功能机制。本研究获得了以上直接实验证据,确证了Mt DGD1在豆科植物根瘤菌入侵、根瘤发育和共生固氮中的功能,也表明了DGDG在根瘤共生固氮过程中的重要性。聚半乳糖醛酸酶基因(Polygalacturonase,PG)普遍存在于高等植物细胞中,因其能够降解细胞壁、促进细胞分裂和果实成熟等功能,而与植物生长发育过程中有着非常密切的联系。本研究以豆科模式植物蒺藜苜蓿一个PG(Medtr6g005630)基因为对象,对该基因进行了简单生物信息学分析,该基因全长4150 bp,其中编码区1278 bp,编码425个氨基酸;对其编码的聚半乳糖醛酸酶的保守结构域分析结果发现:该酶包括PL-6 superfamily和Glycoydro8两个与细胞壁主要成分--果胶降解有关的保守结构域;氨基酸序列比对和系统进化分析发现该酶与鹰嘴豆、赤豆等豆科植物中的同源关系更近。此外,根据苜蓿基因表达谱数据库分析和RT-PCR实验结果揭示Mt PG在根瘤中特异性表达,而在其他非共生组织如根、茎、叶中表达量很少;此外,从英国John Innes Centre获赠3种Tnt1转座子插入突变体材料(NF0999、NF5561和NF4746),通过对该基因Tnt1转座子插入位点分析设计引物,利用PCR进行突变体筛选、验证及纯合突变体共生表型观察分析等方面揭示了该基因可能对豆科植物共生固氮中的早期侵染过程有很重要的作用。

关键词：蒺藜苜蓿 MtDGD1 启动子 DGDG LC-MS 共生表型 PG 聚半乳糖醛酸转座子插入突变

Cytophaga hutchinsonii纤维素降解相关基因chu0922及chu2830功能的研究

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Cytophaga hutchinsonii纤维素降解相关基因chu0922及chu2830功能...

作者：苏亚茹山东大学

学位级别：硕士

纤维素作为一种产量丰富的清洁能源,已经被越来越多的国家用来作为石油等化石能源的替代资源。自然界中主要凭借微生物的分解作用使纤维素腐烂,从而进一步被水解成单糖被利用。纤维素由于含有结晶区和非结晶区两部分而不容易被微生物利... 详细信息

纤维素作为一种产量丰富的清洁能源,已经被越来越多的国家用来作为石油等化石能源的替代资源。自然界中主要凭借微生物的分解作用使纤维素腐烂,从而进一步被水解成单糖被利用。纤维素由于含有结晶区和非结晶区两部分而不容易被微生物利用,主要是因为结晶区存在多种分子间作用力,使其结构十分紧密。而各种纤维素酶却能通过合作或者组合成一个复合体的形式巧妙地解决这一难题。Cytophaga hutchinsonii分布范围较大,是一种细长杆状的革兰氏阴性菌,主要以纤维素为营养来源。特殊的是,***不编码可以水解纤维素结晶区的外切纤维素酶,并且它含有的内切纤维素酶缺少能结合纤维素的CBM结构域。在***表面也没有观察到类似纤维小体的结构。***通过接触来直接感应纤维素的存在,从而启动降解程序。因此推测该菌存在第三种纤维素降解机制,但是这种降解机制的具体功能仍未解释清楚。经过数位研究者多年的探索,***的遗传操作体系得到了建立并进行了完善,许多重要的功能基因相继被发现和研究,丰富了人们对***的认识。本文成功筛选到一些重要的基因,并详细研究了其中两个突变株的表型,最后初步探讨了突变株影响纤维素降解的机制的原因。具体研究内容如下:***922基因功能的研究随机插入突变长出了一个不能降解纤维素的突变株,转座子具体的插入失活位点鉴定为chu922。利用同源双交换的方法将该基因敲除后得到的转化子与插入突变得到突变株的表型相同,都不能在滤纸上生长。RT-PCR验证后发现该基因缺失后并不影响其上下游基因的正常转录,证明该表型确实是由chu922缺失导致的。chu922编码一个未知功能蛋白,其基因序列包含信号肽及T9SS蛋白分泌系统识别的信号序列CTD,所以,我们推测CHU922可能是T9SS的底物蛋白,经过T9SS被分泌到细胞外。进一步分析突变株△0922在各种碳源中的生长,发现A0922可以在glucose、cellobiose中正常生长,RAC中突变株表现出了长达72 h的生长延滞期,而在Avicel中则完全不生长,说明无定型纤维素及结晶纤维素不能正常被△0922利用。观察突变株在PY2表面的扩散情况发现,chu922的缺失导致单个菌体的运动能力及菌落的扩散情况都出现了缺陷。用扫描电子显微镜(SEM)观察菌体处理后的纤维素样品发现,WT处理后的纤维素表面整齐光滑,而突变株处理后的纤维素表面粗糙,与未经菌体处理的纤维素表面差异不大。通过XRD检测纤维素样品的结晶度,发现经过WT菌株处理后的纤维素结晶度降低,而纤维素被突变株A0922降解后,结晶度呈现出上升的趋势。这表明A0922对纤维素的利用具有一定选择性,它只利用了松散的无定型区域,对结晶区的降解似乎非常吃力。质谱鉴定突变株的外膜差异蛋白发现,chu922的缺失导致一些外膜蛋白的表达水平降低,如CHU276,CHU277,CHU279。提取突变株的mRNA进行RT-qPCR检测 chu276-1279 的转录水平发现,chu277,chu278,chu278 chu279在突变株中的转录水平较WT来说显著降低,且chu276与chu277这一下调趋势在RAC培养条件下更加明显。前期研究表明,CHU276缺失后会导致菌体完全不能降解纤维素,并且菌体对低浓度的葡萄糖或纤维二糖的利用也出现了明显的缺陷;CHU277失活后使突变株不能利用纤维素及纤维寡糖。它们对***来说是其正常发挥功能的关键基因。但是后续研究发现,单独提高chu276-1279中的任何一个基因的表达水平都不能恢复突变株对滤纸的降解能力。设置梯度浓度的glucose底物来培养*** 发现,从生长速率来看,WT菌株的生长速率不随条件变化而改变,但A0922的生长速率却随着葡萄糖浓度的降低而减小;相同的是,WT和突变株的最大生物量都随着糖浓度的升高而增加。检测休止状态的细胞对葡萄糖的吸收发现,突变株A0922的休止细胞对0.1%及0.4%的葡萄糖吸收几乎与WT 一致。在Stanier琼脂培养基中加入0.1%的葡萄糖后,再进行滤纸降解,发现此时突变株可以使滤纸变黄,仍然不能降解结晶纤维素。***830基因功能的研究筛菌过程中发现一个能降解滤纸,但速度较慢的突变株,经比对发现转座基因破坏了chu830的基因序列。chu830编码一个位于细胞质膜的带有TPR重复的未知功能蛋白,该基因的缺失导致菌体对纤维素的利用速度变慢,且突变株的运动能力出现缺陷。我们进一步分析△2830在不同碳源条件下的生长曲线,发现突变株在葡萄糖、纤维二糖为唯一碳源时,生长能力不受影响,生长速率及最大生物量甚至要高于野生型菌株。但是当

关键词： Cytophaga hutchinsonii 转座子插入突变纤维素降解外膜蛋白纤维素结晶区葡萄糖吸收