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马铃薯转化酶抑制子St-inh cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达和功能测定

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实验生物学报 2004年第4期37卷 269-275页

作者：成善汉柳俊宋波涛谢从华国家蔬菜改良中心华中分中心华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室武汉430070

用RT-PCR结合5’RACE方法从马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh 全长cDNA。序列分析表明,St-inh 基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将含St-inh 基因cDNA 的DNA 片段克隆到pET28a(+)上,转化大肠杆... 详细信息

用RT-PCR结合5’RACE方法从马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh 全长cDNA。序列分析表明,St-inh 基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将含St-inh 基因cDNA 的DNA 片段克隆到pET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功实现了表达。基因表达产物与马铃薯栽培品种(系)E1、JH 试管块茎以及番茄果实的转化酶提取物共孵育结果显示,转化酶活性分别下降了34.3%、21%和33.8%,说明St-inh 的翻译产物具有转化酶抑制子功能。BLAST 基因序列分析表明,St-inh 与Kunitz-type C 类基因序列同源性达95%以上,T-COF-FEE 氨基酸序列对比分析显示,该基因编码的蛋白质具有典型的Kunitz-type 结构域[L,I,V,M]-X-D-X-[E,D,N,T,Y]-[D,G]-[R,K,H,D,E,N,Q]-X-[L,I,V,M]-X(5)-Y-X-[L,I,V,M],因此,Sit-inh 基因可能为Kunitz-type 家族成员。

关键词：马铃薯转化酶抑制子 St-inhcDNA 克隆大肠杆菌表达

甘蔗转化酶抑制子(SoInvInh1)基因克隆和表达分析

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中国农业大学学报 2015年第3期20卷 38-45页

作者：牛俊奇黄静丽张琨琨杨丽涛李杨瑞广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530005 中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室南宁530007

采用cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以甘蔗未成熟茎cDNA为模板克隆转化酶抑制子,命名为SoInvInh1,GenBank登录号KF575175。SoInvInh1基因的cDNA序列全长为678bp,3′-UTR长146bp。开放阅读框长531bp,编码176个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.09ku和8.52。SoInvInh1不含内含子序列。预测该蛋白N端具有1个信号肽和跨膜结构,19—172位氨基酸是PMEI蛋白的保守结构域。不同物种间InvInh蛋白氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点。荧光定量PCR分析表明在甘蔗茎、叶、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh1基因表达。在甘蔗生长的不同时期,SoInvInh1在叶中表达无明显规律。而在工艺成熟期和生理成熟前期SoInvInh1整体上表现为幼茎中基因表达量高,而老茎中基因表达量低,表明茎中该基因可能与酸性转化酶活性相关。

关键词：甘蔗转化酶抑制子克隆基因表达

烟草液泡转化酶抑制子基因调控马铃薯块茎低温还原糖累积的研究

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中国农业科学 2007年第1期40卷 140-146页

作者：成善汉宋波涛谢从华李竟才柳俊国家蔬菜改良中心华中分中心/园艺植物生物学教育部重点实验室/湖北省马铃薯工程技术研究中心华中农业大学园艺林学学院武汉430070

【目的】克隆烟草液泡转化酶抑制子基因,并在马铃薯中表达,从而抑制低温贮藏块茎还原糖积累,提高马铃薯加工品质。【方法】通过RT-PCR法分离Nt-VIF全长cDNA,转化马铃薯植株,PCR、Northern杂交和Southern杂交检测转基因植株,转基因植株... 详细信息

【目的】克隆烟草液泡转化酶抑制子基因,并在马铃薯中表达,从而抑制低温贮藏块茎还原糖积累,提高马铃薯加工品质。【方法】通过RT-PCR法分离Nt-VIF全长cDNA,转化马铃薯植株,PCR、Northern杂交和Southern杂交检测转基因植株,转基因植株块茎在低温和常温条件下贮藏30d,分析转化酶活性与还原糖含量。【结果】克隆到Nt-VIF全长cDNA,35S调控下正向的Nt-VIF基因cDNA已经成功转入鄂马铃薯3号(E3)植株。转基因植株块茎在4℃和20℃贮藏30d表明,VI活性受温度调节,高温贮藏块茎的VI活性显著低于低温贮藏的块茎,且高温条件下转基因块茎与对照无显著差异,而低温条件下转基因块茎的VI活性与对照相比下降幅度为22.7%(株系A-3)～78.1%(株系A-31)。转基因块茎还原糖(RS)含量在高温贮藏条件下与对照差异亦不明显,而低温贮藏条件下RS含量下降幅度为20%(株系A-17)～80.5%(株系A-30)。进一步分析还表明,转基因块茎低温贮藏其液泡转化酶活性与还原糖含量呈显著正直线相关(RS=0.289VI+0.0736)。【结论】Nt-VIF基因的表达显著抑制了马铃薯液泡转化酶活性,导致还原糖积累降低。

关键词：马铃薯低温糖化转化酶抑制子遗传转化

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番茄转化酶抑制子基因克隆及其表达分析

植物生理学通讯 2009年第3期45卷 233-238页

作者：姜晶李冬妮孙威沈阳农业大学园艺学院辽宁省设施园艺重点实验室沈阳110161

从普通栽培型番茄品种‘桃太郎’、野生醋栗番茄和潘那利番茄的幼苗中采用RT-PCR方法,扩增出转化酶抑制子基因cDNA序列的部分片段。经测序表明:不同基因型番茄的转化酶抑制子基因同源性高达97.97%以上。采用半定量RT-PCR方法对‘桃太郎... 详细信息

从普通栽培型番茄品种‘桃太郎’、野生醋栗番茄和潘那利番茄的幼苗中采用RT-PCR方法,扩增出转化酶抑制子基因cDNA序列的部分片段。经测序表明:不同基因型番茄的转化酶抑制子基因同源性高达97.97%以上。采用半定量RT-PCR方法对‘桃太郎’苗期根、茎、叶和花后功能叶、花期子房以及果实不同发育阶段不同部位的表达进行检测,结果表明:INH在根中表达较弱,茎中有强烈表达,从幼叶到衰老叶表达逐渐减弱;同一时期INH在果肉中表达相对较强,维管束次之,胶质胎座相对较弱;花期子房中INH的表达逐渐增强,花后3d左右达到最大,花后5～8d表达量迅速下降。

关键词：番茄转化酶抑制子 RT-PCR 基因表达

甘蔗转化酶抑制子SoInvInh2基因克隆和表达分析

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西南农业学报 2018年第11期31卷 2239-2247页

作者：牛俊奇黄金容苗小荣王道波杨丽涛李杨瑞玉林师范学院生物与制药学院广西玉林537000 广西农产资源化学与生物技术重点实验室广西玉林537000 广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西南宁530005 中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院甘蔗研究所广西南宁530007

【目的】克隆甘蔗转化酶抑制子(Invertase inhibitor)基因(SoInvInh2)的c DNA全长序列,分析基因表达模式和生物信息学特性,为该基因功能的进一步鉴定提供依据。【方法】基于同源序列克隆InvInh2基因5'序列,采用Tail-PCR技术扩增基因3'... 详细信息

【目的】克隆甘蔗转化酶抑制子(Invertase inhibitor)基因(SoInvInh2)的c DNA全长序列,分析基因表达模式和生物信息学特性,为该基因功能的进一步鉴定提供依据。【方法】基于同源序列克隆InvInh2基因5'序列,采用Tail-PCR技术扩增基因3'序列。采用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和系统进化等进行分析。采用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoInv Inh2基因在甘蔗不同生育期的组织表达特性。【结果】从甘蔗GT28幼茎中克隆到的一个新的转化酶抑制子基因,命名为SoInv Inh2,GenBank登录号KF575170。该基因的c DNA序列全长为927 bp,开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸。SoInvInh2基因不含内含子序列。SoInvInh2蛋白有4个不对称的α-螺旋和4个保守的Cys位点,属于InvI/PMEI家族成员。在甘蔗叶、茎、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh2基因表达。在甘蔗不同生育期,So Inv Inh2基因在不同成熟度的叶和茎中的表达模式无明显规律。【结论】成功克隆到甘蔗SoInvInh2基因,并进行相关生物信息学分析,为该基因的进一步功能研究奠定了基础。

关键词：甘蘸转化酶抑制子基因克隆基因丧达

木薯转化酶抑制子MeINH3基因的克隆及生物信息学分析

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热带作物学报 2014年第9期35卷 1715-1720页

作者：吴晓慧耿梦婷范洁姚远符少萍胡新文郭建春海南大学农学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101

转化酶抑制子调控转化酶的活性,在植物的糖代谢过程中具有重要作用。为了研究木薯的转化酶抑制子,本实验利用木薯基因组数据库分析及RT-PCR方法,从木薯中分离了1个木薯转化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列长度为564 bp,包含528 b... 详细信息

转化酶抑制子调控转化酶的活性,在植物的糖代谢过程中具有重要作用。为了研究木薯的转化酶抑制子,本实验利用木薯基因组数据库分析及RT-PCR方法,从木薯中分离了1个木薯转化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列长度为564 bp,包含528 bp的完整开放阅读框,编码127个氨基酸,N端有16个氨基酸残基的信号肽,4个保守的半胱氨酸残基可形成两个二硫桥。亚细胞定位预测表明,MeINH3蛋白定位于胞外。根据生物信息学分析结果,推测其可能抑制木薯细胞壁转化酶活性。

关键词：木薯转化酶抑制子基因克隆生物信息学分析

铁皮石斛转化酶抑制子家族基因的克隆和表达分析

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生物技术通报 2018年第1期34卷 129-136页

作者：苗小荣牛俊奇莫昭展王爱勤何龙飞广西大学农学院南宁530005 玉林师范学院生物与制药学院玉林537000

转化酶抑制子(Invertase Inhibitor,Inv Inh)能调控转化酶的活性,在植物的蔗糖代谢过程中具有重要作用。本研究旨在从珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中克隆Inv Inh家族基因,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。结果显示:从铁皮石斛... 详细信息

转化酶抑制子(Invertase Inhibitor,Inv Inh)能调控转化酶的活性,在植物的蔗糖代谢过程中具有重要作用。本研究旨在从珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中克隆Inv Inh家族基因,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。结果显示:从铁皮石斛叶中克隆到3个Inv Inh基因,分别命名为Do Inv Inh1、Do Inv Inh2和Do Inv Inh3,分别编码176、177和188个氨基酸。生物信息学分析表明,Do Inv Inh蛋白都具有1个信号肽、2个跨膜结构以及PMEI蛋白的保守结构域。Do Inv Inh蛋白的氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点和SP位点。荧光定量PCR分析发现,在根、茎、叶和花中都能检测到3个Do Inv Inh基因表达。Do Inv Inh2和Do Inv Inh3基因在根中表达量最低,而在花中表达量最高。Do Inv Inh1和Do Inv Inh3基因在铁皮石斛不同生长年限茎中的表达模式相似,都是在1年生茎中表达量最高,2年生茎中次之,在3年生茎中表达量最低。Do Inv Inh2基因在2年生茎中基因表达量最高。Do Inv Inh1和Do Inv Inh3基因表达量与CIN酶活性都呈显著负相关,推测这2个基因可能在调节茎中CIN酶活性中起作用。

关键词：铁皮石斛转化酶抑制子基因克隆基因表达

野生茄转化酶抑制子基因StINH1的克隆与序列分析

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西北农业学报 2013年第8期22卷 162-167页

作者：叶雪凌刘志勇周宝利沈阳农业大学园艺学院沈阳110866

以1个受黄萎病菌诱导的"托鲁巴姆"下调EST为种子序列,在NCBI进行同源搜索,经人工拼接、RT-PCR克隆与序列分析验证,获得野生茄"托鲁巴姆"转化酶抑制子基因(INH)的全长cDNA序列,命名为StINH1。该基因的开放阅读框全长531bp,编码176个氨基... 详细信息

以1个受黄萎病菌诱导的"托鲁巴姆"下调EST为种子序列,在NCBI进行同源搜索,经人工拼接、RT-PCR克隆与序列分析验证,获得野生茄"托鲁巴姆"转化酶抑制子基因(INH)的全长cDNA序列,命名为StINH1。该基因的开放阅读框全长531bp,编码176个氨基酸,与电子克隆获得的序列完全相同。编码蛋白的分子质量为19.916ku,理论等电点为5.14。序列分析表明,该基因属于植物PMEI超家族,编码的前体蛋白含有1个拥有19个氨基酸的前导肽,同时含有多个磷酸化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后,StINH1在"托鲁巴姆"根中呈下调表达。

关键词：野生茄黄萎病转化酶抑制子

番茄转化酶抑制子基因的果实特异性表达载体构建及功能研究

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番茄转化酶抑制子基因的果实特异性表达载体构建及功能研究

作者：杨芳沈阳农业大学

学位级别：硕士

转化酶抑制子(INVINH)是高等植物中一类全新的由小基因编码的蛋白质家族,近年来成为在翻译后水平研究植物光合运转糖调控植物产品器官发育和品质的重要因子。但INVINH在进化过程中基因变异较大,对其基因的克隆及生理作用的阐述还只是刚... 详细信息

转化酶抑制子(INVINH)是高等植物中一类全新的由小基因编码的蛋白质家族,近年来成为在翻译后水平研究植物光合运转糖调控植物产品器官发育和品质的重要因子。但INVINH在进化过程中基因变异较大,对其基因的克隆及生理作用的阐述还只是刚开始。本研究在已克隆出番茄转化酶抑制子INH基因,并通过RT-PCR方法对其在不同时期不同部位的表达情况进行检测基础上,利用果实特异性启动子2A11控制外源基因在植物果实中高效表达,对转化酶抑制子基因功能的研究,为进一步用转基因技术探讨该基因在番茄蔗糖代谢中分子生物学机制建立基础资料。主要内容如下：1.以番茄Micro-Tom等不同番茄的DNA为模板,通过PCR扩增,克隆出果实特异性启动子2A11并进行序列分析,结果表明：番茄材料均比2A12在151-183序列间多了28bp,这说明该序列在不同番茄品种之间还是存在一定的差异性。不同基因型番茄的果实特异性启动子基因同源性高达90%以上。2.利用限制性内切酶BamHⅠ, HindⅢ切下果实特异性启动子2A11片段插入到载体p1300上形成表达载体p1300-2A11, BamHⅠ, KpnⅠ分别酶切INH基因和p1300-2A11,回收纯化后,经T4DNA连接酶连接得到重组质粒p1300-2A11-INH,将连接产物p1300-2A11-INH转化大肠杆菌感受态细胞中,进行酶切和PCR鉴定。3.用GUS做为报告基因对农杆菌注射形成的瞬时表达系统进行检测,并对转化酶活性进行测定分析。表明转化酶抑制子只在果实中有表达,而叶片上无表达。并同未注射农杆菌和注射空载体的果实进行对照,发现转化酶活性降低,结果表明转化酶抑制子INH可以抑制转化酶活性。

关键词：转化酶抑制子果实特异性启动子表达载体瞬时表达