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分子植物育种 2018年第23期16卷 7821-7826页

作者：江喻罗世家邓志军刘欢邓仕明湖北民族学院生物资源保护与利用湖北省重点实验室恩施445000 湖北民族学院林学园艺学院恩施445000

本研究应用了加压液体萃取(pressurized liquid extraction,PLE)、微波辅助萃取(microwave assisted extraction,MAE)和超声辅助萃取(ultrasound assistedextraction,UAE)三种现代提取技术对车前叶蓝蓟籽油进行提取,并对乙酸乙酯、乙醇、水及其混合液作为溶剂的萃取条件进行了优化,以实现作为正己烷的替代绿色萃取溶剂。本研究表明,乙醇是一种作为车前叶蓝蓟籽油提取的非常有优势的绿色提取溶剂。PLE提取产量最高(32.1%),但温度也相对较高,可能导致部分不稳定化合物热降解。UAE(29.8%)的主要特点是在温和条件下进行的,低温(60℃)允许使用UAE作为热不稳定化合物的提取。另一方面,无论是开放系统(22.6%)还是封闭系统(24.9%),MAE都显示出所有测试技术的最低产油量。然而,MAE的优势主要是节省时间,并且可以每隔几分钟可重复进行一次快速有效的萃取。

关键词：车前叶蓝蓟籽油加压液体萃取微波辅助萃取超声辅助萃取

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车前叶蓝蓟毛状根的诱导以及转录组分析发掘紫草素合成正相关基因

车前叶蓝蓟毛状根的诱导以及转录组分析发掘紫草素合成正相关基因

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作者：郭玉敏南京大学

学位级别：硕士

紫草素类化合物(alkannin/shikonin and their derivatives)是存在于紫草族(***)植物根部的一类天然活性物质。这类化合物不仅是著名的天然红色色素,还是一种重要的药用天然产物,具有抗菌、消炎、促进伤口愈合等作用。目前,国内外对于... 详细信息

紫草素类化合物(alkannin/shikonin and their derivatives)是存在于紫草族(***)植物根部的一类天然活性物质。这类化合物不仅是著名的天然红色色素,还是一种重要的药用天然产物,具有抗菌、消炎、促进伤口愈合等作用。目前,国内外对于紫草素类化合物的研究主要集中于硬紫草、新疆软紫草、滇紫草等紫草科(Boraginaceae)植物。车前叶蓝蓟(Echiunmplantagineum)属紫草科蓝蓟属(Echium)的草本灌木,具有易种植,繁殖快,环境适应性强等优点。以前研究发现车前叶蓝蓟的根部,以及诱导获得的愈伤组织都能够合成紫草素类化合物。因此,本研究结合所在课题组已有的关于紫草科植物生产紫草素类化合物的研究背景,首先诱导了车前叶蓝蓟的毛状根诱导体系;其次,还利用转录组分析发现了一些车前叶蓝蓟中与紫草素合成正相关的基因。具体结果如下:1.本研究使用发根农杆菌ATCC15834成功诱导了车前叶蓝蓟毛状根体系,为代谢工程规模化生产紫草素类化合物以及相关转基因研究提供了一定的基础。2.本研究利用RNA-seq技术对车前叶蓝蓟不同时间点的幼根及幼叶、成熟主根不同部分的样品进行了转录组测序与分析,de novo组装获得121004个Unigenes基因,N50长度达2.1kb。对de novo组装结果进行基因本体和通路分析以及各样品间的Unigenes表达量分析,共获得1088个Unigenes基因可能与紫草素生物合成正相关的候选基因,从中选取G8H基因集(推测属于紫草素合成代谢途径)以及12OPR基因集(属于茉莉酸甲酯代谢途径)进行后续研究。3.进一步的进化分析与表达水平比较,分别筛选得到G8H-CL14070.1基因拷贝以及12OPR-CL430.3基因拷贝,并对两个拷贝的开放阅读框区(open reading fram,ORF)进行全长扩增,获得了它们的全长CDS序列。综上所述,本研究为车前叶蓝蓟中紫草素合成分子代谢的研究奠定了一定基础,并且为代谢工程规模化生产紫草素类化合物以及相关转基因研究提供了一定的基础。

关键词：车前叶蓝蓟紫草素毛状根转录组 G8H 12OPR

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播期对不同品种车前叶蓝蓟生长和光合作用及产量的影响

播期对不同品种车前叶蓝蓟生长和光合作用及产量的影响

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作者：王武吉林农业大学

学位级别：硕士

车前叶蓝蓟的籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸,是优秀的特种油料作物在医疗、卫生、保健、美容、化妆品和食品上及农业生产上被广泛运用,因此提高车前叶蓝蓟的产量前景广阔。为有效地利用当地的光热资源,提高车前叶蓝蓟对光能的利用,促进... 详细信息

车前叶蓝蓟的籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸,是优秀的特种油料作物在医疗、卫生、保健、美容、化妆品和食品上及农业生产上被广泛运用,因此提高车前叶蓝蓟的产量前景广阔。为有效地利用当地的光热资源,提高车前叶蓝蓟对光能的利用,促进车前叶蓝蓟的生长和产量我们设计了本实验的研究。本实验以车前叶蓝蓟品种B(Blue Bedder)和品种M(Mixed Bedding)为研究对象,探究不同播期对车前叶蓝蓟物候期,植株生长,光合作用及产量的影响。实验于2021年和2022年在吉林农业大学校内实验基地进行。实验采取完全随机区组设计,并设置5个不同的播期:5月1日、5月8日、5月15日、5月22日、5月29日,每处理3次重复。主要研究结果如下:1.物候期:推迟播期导致车前叶蓝蓟生育进程加快,使得品种M和品种B出苗期,苗期,莲座期,伸展分枝期和总生育期明显缩短。品种M的最晚播期较最早播期总生育期减少17 d,而品种B的最晚播期较最早播期总生育期减少24 d。品种M相较于品种B生长较快,且生育周期较短。品种M与品种B的生育期差异,主要集中在莲座期,伸展分枝期。2.生育特性:适当推迟播期可使车前叶蓝蓟最终株高、侧枝长(最长)、花茎长(最长)、粒长和粒宽显著增加,而一级侧枝数显著减少。推迟播期不利于品种M和品种B早期功能叶片增大。在开花结实阶段,播期对车前叶蓝蓟植株功能叶片大小的影响较小。品种M早期发育较快,株高相对高于品种B,但在生育后期株高会率先出现下降。无论播期如何,品种B于各播期的主茎长、花茎长(最长)、侧枝长(最长)、粒长和粒宽小于品种M,而一级侧枝数,侧枝长(最长)、根长、根粗、地上部和地下部(根)的干鲜重大于品种M。3.光合作用:随着播期延迟,品种B开花期功能叶片的叶绿素含量(SPAD)、光合速率(P)、蒸腾速率(T)、气孔限制值(L)、光化学淬灭(q P)、电子传递速率(ETR)和实际光化学效率(ΦpsⅡ)呈递减趋势,于T1播期达到最大值,而品种M的开花期功能叶片SPAD、P、T、用水效率(WUE)、L、初始荧光(F)、最大荧光(F)、q P、ETR和ΦpsⅡ皆以T4播期下最高。同一播期条件下,品种B开花期总冠层光截获率(Ca R)、SPAD、P、T、L、最大光化学效率(F/F)、ETR和ΦpsⅡ明显高于品种M。所以品种B的光合性能优于品种M。4.产量:品种B的于各播期产量明显高于品种M,即品种B籽粒产出性能高于品种M。随着播期延迟,品种B的产量呈下降的趋势,于T1播期下达到最大值996.72kg/hm。而不同播期处理下,品种M的籽粒产量表现为T2车前叶蓝蓟的物候期,光合作用以及产量特性对播期的响应都呈现了一定的差异性。因此,不同播期可以通过调节车前叶蓝蓟生育进程和农艺性状来优化种群结构和光热资源,提高其光合能力,改善产量构成,从而提高产量。分析表明:品种B在T1时期,品种M在T4时期播种产量最高,因此,种植时应将品种B于T1时期早播,品种M于T4时期晚播,有助于提高车前叶蓝蓟的光合作用并提高籽粒产量。

关键词：播期车前叶蓝蓟生长光合产量

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车前叶蓝蓟毛状根的诱导以及转录组分析

车前叶蓝蓟毛状根的诱导以及转录组分析

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江苏省遗传学会2017年学术研讨会——“技术创新与遗传学发展”

作者：郭玉敏傅江燕陆蕴婷汤程贻戚金亮庞延军杨荣武杨永华南京大学

紫草素类化合物(alkannin/shikonin and their derivatives)是存在于紫草族(***)植物根部的一类天然活性物质。其不仅是一种著名的天然红色色素,还是一种重要的药用天然产物,具有抗菌、消炎、促进伤口愈合等作用。目前,国内外对于紫草... 详细信息

紫草素类化合物(alkannin/shikonin and their derivatives)是存在于紫草族(***)植物根部的一类天然活性物质。其不仅是一种著名的天然红色色素,还是一种重要的药用天然产物,具有抗菌、消炎、促进伤口愈合等作用。目前,国内外对于紫草素类化合物的研究主要集中于硬紫草,新疆软紫草,滇紫草等紫草科(Boraginaceae)植物。车前叶蓝蓟(Echiunmplantagineum)属紫草科蓝蓟属(Echium)的草本灌木,具有易种植,繁殖快,环境适应性强等优点。因此,本研究诱导了车前叶蓝蓟的毛状根诱导体系;其次,还利用转录组分析发现了一些车前叶蓝蓟中与紫草素合成正相关的基因。具体结果如下:1.使用发根农杆菌ATCC15834成功诱导了车前叶蓝蓟毛状根体系。2.本研究利用RNA-seq技术对车前叶蓝蓟不同时间点的幼根及幼叶、成熟主根不同部分的样品进行了转录组测序与分析,de novo组装获得121004个Unigenes基因,N50长度达2.1kb。对de novo组装结果进行基因本体和通路分析以及各样品间的Unigenes表达量分析,共获得1088个Unigenes基因可能与紫草素生物合成正相关的候选基因。3.筛选得到12OPR-CL430.3基因拷贝,并对ORF区(开放阅读框)进行全长扩增,获得了它们的全长CDS序列。本研究为车前叶蓝蓟中紫草素合成分子代谢的研究奠定了一定基础,并且为代谢工程规模化生产紫草素类化合物以及相关转基因研究提供了一定的基础。

关键词：车前叶蓝蓟紫草素毛状根转录组

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车前叶蓝蓟（Echium plantagineum）毛状根的紫草素合成特性及关键基因的筛选与功能研究

车前叶蓝蓟（Echium plantagineum）毛状根的紫草素合成特性及关...

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江苏省遗传学会2019年学术研讨会

作者：傅江燕杨旻恺文钟灵王昭月王明月鲍家鑫汤程贻陆桂华戚金亮杨永华南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室植物分生物学研究所

紫草宁及其衍生物广泛存在于紫草科植物的根表面,可以用于食物或布料的染色剂,在治疗各种皮肤疾病,以及抗菌、抗炎、治疗癌症等方面有着一定的疗效。目前对紫草宁及其衍生物的合成通路研究并不全面,主要分为上游骨架途径和下游核心途径... 详细信息

紫草宁及其衍生物广泛存在于紫草科植物的根表面,可以用于食物或布料的染色剂,在治疗各种皮肤疾病,以及抗菌、抗炎、治疗癌症等方面有着一定的疗效。目前对紫草宁及其衍生物的合成通路研究并不全面,主要分为上游骨架途径和下游核心途径,其中对下游通路研究甚少。研究发现,NH4+与光照明显抑制紫草素的合成,茉莉酸则起着正向诱导作用。目前紫草素的研究对象多为硬紫草（Lithospermum erythorhizon）的愈伤细胞,但该物种生长周期长,种植困难,且愈伤细胞并不利于基因研究。此外广泛使用的两阶段"培养——诱导"法,其中的M9无铵培养基不利于愈伤细胞或毛状根的繁殖。因此,本研究以紫草科蓝蓟属中,生长繁殖快的,与硬紫草近源的车前叶蓝蓟（Echium plantagineum）为研究材料,比较其毛状根在1/2B5培养基与M9培养基中生产紫草素的区别;基于参考基因组数据,重分析车前叶蓝蓟与硬紫草的转录组数据,筛选潜在的紫草素合成相关基因;通过毛状根体系对筛选得到的EpGHQH1和EpOPR1基因进行功能研究。主要研究内容与结果如下:1、结果发现,相同培养周期内,毛状根在M9培养基的乙酰紫草宁产量最高达191.05 mg/g（FW）,但因为生物量几乎不增加,平均乙酰紫草宁总产量仅为46.44 mg;在1/2B5培养基中的乙酰紫草宁产量最高为119.14 mg/g（FW）,但因为生长量大,平均乙酰紫草宁总产量为122.8 mg,约为M9中的3倍。因此,1/2B5培养基有利于车前叶蓝蓟毛状根的繁殖与紫草素诱导。2、通过有参转录组数据分析,发现硬紫草基因组中有165个基因在紫草根部且根周皮中高表达,车前叶蓝蓟中则有406个基因与紫草素合成具有较高的正相关性。此前无参转录组分析发现的GHQH与OPR家族都在硬紫草与车前叶蓝蓟中与紫草素合成正相关,对这些拷贝构建进化树,根据直系同源基因进化规律,找到同时含有在两个物种中高表达拷贝的亚支,挑选最高表达量的基因,即GHQH基因家族中的EP37921基因,以及OPR基因家族中的EP41466基因进行后续研究。3、利用毛状根体系对筛选得到的EpGHQH1和EpOPR1两个基因进行转基因功能研究。结果显示,过表达EpGHQH1基因可显著促进车前叶蓝蓟毛状根中紫草素的合成,而干扰该基因的表达则显著抑制紫草素产量,揭示了EpGHQH1对车前叶蓝蓟中紫草素合成的正向调控作用,推测可能是紫草素合成下游途径的一员。过表达EpOPR1基因对紫草素合成并没有明显的促进作用,而干扰该基因后紫草素合成受到抑制。蛋白序列特征显示,该蛋白属于SubI型OPR蛋白,可能并不主要参与植物中茉莉酸的合成,具体功能待进一步研究。

关键词：紫草素合成毛状根车前叶蓝蓟转录组分析 GHQH OPR 转基因

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紫草科植物ABC转运蛋白家族基因的鉴定与LeMDR3关键功能域的研究

紫草科植物ABC转运蛋白家族基因的鉴定与LeMDR3关键功能域的研究

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作者：鲍家鑫南京大学

学位级别：硕士

紫草科植物,如新疆紫草（Arnebia euchroma）和硬紫草（Lithospermum erythrorhizon）,是我国传统中草药植物,紫草宁及其衍生物（紫草素）是从紫草红根中分离出来的萘醌类化合物,具有广泛的抗肿瘤活性、抑菌作用与消除炎症等功效。紫草... 详细信息

紫草科植物,如新疆紫草（Arnebia euchroma）和硬紫草（Lithospermum erythrorhizon）,是我国传统中草药植物,紫草宁及其衍生物（紫草素）是从紫草红根中分离出来的萘醌类化合物,具有广泛的抗肿瘤活性、抑菌作用与消除炎症等功效。紫草素的合成通路主要由甲羟戊酸途径与苯丙素途径构成,基于长久以来对这两个途径中催化酶的研究,通路中大部分节点已较为明确。近期又有一些工作的发表,使得其生物合成通路越来越清晰。涉及次生代谢物质的研究,除关注生物合成过程外,还要考虑合成过程中中间产物及最终产物的积累与转运。鉴于ABC转运蛋白在许多研究中表明参与物质转运有关,基于全基因组测序数据从紫草科植物中鉴定ABC转运蛋白家族成员具有重要科学意义。而且本课题组前期工作中通过酵母异源功能互补系统鉴定到一个可能参与紫草宁外向运输的ABC转运蛋白,但其关键功能结构域还需进一步阐明。本研究以本课题组已测序得到的硬紫草和车前叶蓝蓟基因组为生物信息学分析数据,以诱导产生的硬紫草愈伤组织细胞为主要实验材料,鉴定了硬紫草和车前叶蓝蓟中的ABC转运蛋白家族成员及重要亚家族成员的表达模式,并进一步对紫草宁合成过程中高表达的Le MDR3转运蛋白基因进行研究,通过酵母异源表达系统阐明其关键功能结构域。同时,利用硬紫草愈伤组织细胞的转录组测序-mi RNA组测序-降解组测序联合分析,找寻可能靶向调控硬紫草ABC转运蛋白基因的mi RNAs,为后续研究提供思路和依据。主要研究结果如下:（1）以拟南芥ABC转运蛋白基因为靶序列,从硬紫草基因组中比对到126条同源序列,从车前叶蓝蓟基因组中比对到118条同源序列,保守结构域分析表明,筛选出的候选基因是ABC转运蛋白基因,并对这些基因成员的基本信息进行了表征。鉴于全分子ABC转运蛋白在物质运输中的功能,将硬紫草MDR、MRP与PDR类转运蛋白基因做了进一步分析,包括各亚家族成员的理化性质、基因结构以及氨基酸序列的保守motif等。（2）在课题组前期的工作中,用酵母异源表达系统筛选到一个可能参与紫草宁转运的ABC转运蛋白基因Le MDR3。由于MDR类转运蛋白在许多研究中证实参与植物次生代谢产物的运输,因此对硬紫草MDR类转运蛋白的14个成员进行了表达模式分析。结果表明,Le MDR3在紫草宁产生过程中显著高表达。通过Le MDR3蛋白序列结构分析,采用点突变技术鉴定了其关键的功能域,进一步说明了Le MDR3可能在紫草宁外排过程中起重要作用。（3）为后续深入分析紫草ABC转运蛋白基因的表达调控机制,本文通过转录组测序-mi RNA测序-降解组测序联合分析的方法,挖掘到可能靶向硬紫草ABC转运蛋白基因的7个mi RNA,其中mi R399a可能靶向Le MDR1,mi R169i可能靶向Le MRP1,mi R2603可能靶向Le PDR9。本研究结果为深入探讨紫草科植物次生代谢产物合成过程中的中间产物及最终次生代谢产物的转运和后续深入分析ABC转运蛋白基因的表达调控机制提供了重要的参考依据。

关键词：硬紫草车前叶蓝蓟紫草素 ABC转运蛋白 LeMDR3 功能结构域

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软紫草框架基因组与朱草类植物转录组的测序、组装与初步分析

软紫草框架基因组与朱草类植物转录组的测序、组装与初步分析

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江苏省遗传学会2017年学术研讨会——“技术创新与遗传学发展”

作者：吴凤瑶杨旻恺傅江燕汤程贻戚金亮庞延军杨荣武杨永华南京大学

"朱草"类植物是一类根部由于富含红色萘醌类化合物(即紫草素及其衍生物)而呈红色的植物。紫草素类化合物不仅是一种著名的天然色素,还是一种重要的药用天然产物。然而,由于缺乏相关基因组和转录组数据,目前国内外研究者对紫草素生物合... 详细信息

"朱草"类植物是一类根部由于富含红色萘醌类化合物(即紫草素及其衍生物)而呈红色的植物。紫草素类化合物不仅是一种著名的天然色素,还是一种重要的药用天然产物。然而,由于缺乏相关基因组和转录组数据,目前国内外研究者对紫草素生物合成的基因与分子生物学层面的研究依然不够深入。因此,本研究对软紫草(Arnebia euchroma)的框架基因组进行了测序、组装与初步分析;同时,还分别对三种"朱草"植物,即软紫草、紫草(Lithospermum erythrorhizon)与车前叶蓝蓟(Echium plantagineum)的转录组进行了测序、组装与初步分析。通过K-mer分析本研究估算软紫草基因组大小约为2.7Gb,基因组杂合度约1.5-1.7%,基因组重复率在50%以上。这说明软紫草基因组较大,而且是高杂合、高重复的复杂基因组。因此,本研究仅对其进行了框架基因组的组装;组装所得基因组大小约1.2Gb;并且注释获得28157个蛋白编码基因。比较基因组与分子进化分析推测紫草目可能与茄目更近缘,其可能约在7530万年前与茄目进化分离。转录组测序分析发现在三种"朱草"植物的绿茎叶和红根样品中存在一些极显著差异表达的基因。从中本研究进一步筛选得到了与紫草素生物合成相关的一些新基因。另外,本研究通过比较转录组与分子进化分析进一步构建了唇形支植物的初步系统进化模型。所得结果与基于软紫草基因组所构建的系统进化模型几乎完全一致。这更进一步证明了紫草目可能与茄目更近缘,而与唇形目较远。综上所述,本研究对"朱草"类植物的起源以及紫草素生物合成与调控领域的研究奠定了一定的基础,对紫草素代谢工程的发展具有一定的参考价值。

关键词：朱草软紫草紫草车前叶蓝蓟基因组转录组分子进化紫草素生物合成

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