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铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因的研究

微生物学报 2004年第3期44卷 319-323页

作者：单志英徐海津施兴启乔明强高才昌遇言张秀明白艳玲南开大学生命科学学院天津300071

应用Mu转座重组技术研究铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)蹭行运动 (Twitchingmotility)的相关基因。通过转座突变、表型筛选 ,得到 8个Twitchingmotility缺陷或减弱的突变子。经过基因克隆、核苷酸测序研究 ,鉴定转座子插入到基... 详细信息

应用Mu转座重组技术研究铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)蹭行运动 (Twitchingmotility)的相关基因。通过转座突变、表型筛选 ,得到 8个Twitchingmotility缺陷或减弱的突变子。经过基因克隆、核苷酸测序研究 ,鉴定转座子插入到基因组中的位置。结果表明 ,在其中 4个突变子中 ,转座子分别插入到与IV型菌毛生物合成和功能相关的 3个已知基因中 (其中有两个突变子转座子插入到同一基因的不同位置 ) ,它们是pilV ,pilQ ,algR。另外 4个突变子中 ,有 3个是转座子分别插入到基因pilL基因的前端 ,中部和后端 ,均引起Twitchingmotility功能缺失。另一个突变子中 ,转座子插入到基因PA1 82 1中 ,引起Twitchingmotility功能减弱。PilL和PA1 82 1的编码产物均属于 3 类蛋白质 ,它们的功能是根据其保守的氨基酸基序或基因序列与已知功能基因的相似性推测得出的。但缺乏详细的试验证据。研究结果为pilL控制Twichingmotility提供了有力的证据。并证实基因PA1 82 1与Twitchingmotility有关。将Mu转座重组技术应用到假单胞菌的研究中 ,国内外均未见报道。由于该技术具有随机单点插入的优点 ,克服了传统转座子能在染色体上迁移的缺点。保证了表型的改变与转座子插入位点的基因突变的一一对应关系。

关键词：铜绿假单胞菌 Mu转座重组技术蹭行运动

生防产酶溶杆菌Clp和LctM蛋白调控菌体蹭行运动的机制研究

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生防产酶溶杆菌Clp和LctM蛋白调控菌体蹭行运动的机制研究

作者：陈姣姣南京农业大学

学位级别：硕士

产酶溶杆菌OH 11(Lysobbacter enzymogenes)是一种由辣椒根际土壤中分离得到的农业革兰氏阴性细菌,该菌能产生多种胞外酶,包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶等,能降解不同植物病原菌的细胞壁组分,是一种具有广阔应用前... 详细信息

产酶溶杆菌OH 11(Lysobbacter enzymogenes)是一种由辣椒根际土壤中分离得到的农业革兰氏阴性细菌,该菌能产生多种胞外酶,包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶等,能降解不同植物病原菌的细胞壁组分,是一种具有广阔应用前景的生防细菌。同时,该菌也能合成并外泌一种广谱抗真菌和卵菌次生代谢产物HSAF,通过调节丝状真菌鞘脂类化合物的生物合成,从而抑制病原真菌的生长。近年来,相关研究表明产酶溶杆菌还能够依赖菌体的Ⅳ型菌毛(T4P)吸附在真菌菌丝上,使菌丝消解从而产生生防效果,因此由T4P介导的蹭行运动也被作为产酶溶杆菌生防能力的一个重要指标。本文以产酶溶杆菌OH11为研究对象,探究菌体产生蹭行运动的机理。在产酶溶杆菌中,Clp作为一个全局性调控因子,能调控几丁质酶、次级代谢产物的生物合成以及菌体的蹭行运动,但其调控蹭行运动的机制未知。本文首先通过体外凝胶阻滞电泳实验(EMSA),发现Clp能直接结合在Ⅳ型菌毛合成蛋白PilA编码基因的启动子区。进一步通过启动子截短和EMSA技术,将Clp的结合区域定位到一段41 bp的DNA序列。通过生物信息学分析,在这一段41 bp的DNA序列中发现了Clp的潜在结合位点GTG**********CAC。通过基因定量表达、组成型启动子替换和Western blot杂交等遗传和生化研究,发现这段41 bp的序列的确为Clp的结合位点。以在pilA启动子区发现的Clp结合位点为诱饵,在OH11的全基因组范围内进行扫描,发现222个基因启动子区含有类似的结合位点。从中发现负责Ⅳ型菌毛在周质空间组装的合成基因簇PilMNOPQ的启动子区也存在Clp的结合位点。通过体外EMSA和体内基因定量表达分析,发现Clp可以直接结合在pilM的启动子区,进而正向控制该基因簇的转录。这些研究表明,在产酶溶杆菌OH11中Clp通过一种双重转录调控机制来控制由Ⅳ型菌毛介导的细胞蹭行运动,并且这种调控方式在多种溶杆菌种中相对保守。本实验室前期实验发现,在产酶溶杆菌OH11存在26个与c-di-GMP(环二鸟甘酸)合成代谢相关的蛋白,其中含有退化的GGDEF结构域的Le2996(lctM)过表达后丧失了蹭行运动,于是本文对这种现象背后的分子机制进行了研究。生物信息学分析表明,LctM的N端整合在细菌内膜,含有6次跨膜区;其C端定位在细胞质内,含有一个退化的GGDEF结构域,表明该蛋白是一个没有合成c-di-GMP功能的蛋白。为了探索LctM调控TM的机制,本研究以LctM为诱饵,对19个能控制IV型菌毛合成的Pil蛋白进行了一对一的细菌双杂交筛选,发现跨内膜蛋白PilO能与LctM发生特异性互作。本文初步揭示了全局性调控因子Clp和含有退化的GGDEF结构域的LctM调控蹭行运动的机理,为通过遗传改良提升TM能力,更好地定殖在植物或真菌菌丝上发挥生防效果奠定了基础。

关键词：产酶溶杆菌 Clp LctM 蹭行运动

铜绿假单胞菌蹭行运动与羧苄青霉素耐药相关性的研究

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铜绿假单胞菌蹭行运动与羧苄青霉素耐药相关性的研究

作者：闫蓉西北大学

学位级别：硕士

细菌对抗生素的耐药性日趋增强使得多重耐药菌株也在增多。作为院内感染的主要致病菌之一,铜绿假单胞菌的耐药菌株也频繁出现,这就使得现有的抗生素很难治愈这种细菌所引起的感染。运动性对于病原菌的定植以及出现耐药的主要原因之一的... 详细信息

细菌对抗生素的耐药性日趋增强使得多重耐药菌株也在增多。作为院内感染的主要致病菌之一,铜绿假单胞菌的耐药菌株也频繁出现,这就使得现有的抗生素很难治愈这种细菌所引起的感染。运动性对于病原菌的定植以及出现耐药的主要原因之一的生物被膜的形成非常重要。前期研究发现,临床中分离的蹭行运动能力减弱的菌株多表现为对羧苄青霉素耐药,而部分与菌毛相关的基因突变后并未表现出抗生素抗性。因此本实验基于上述研究,进一步探讨菌体的蹭行运动与其对羧苄青霉素的耐药性之间是否具有一定的相关性?本论文通过两种方案进行研究:首先,构建与菌毛相关基因以及调控基因的突变体,直接确定蹭行运动相关的菌毛编码基因是否影响菌株对羧苄青霉素的抗性。其次,通过转座突变体库的构建,筛选蹭行运动明显降低且对羧苄青霉素敏感性发生变化的突变体,确定其是否是菌毛相关的基因。研究中选择了pilPONM、pilQ、pilF、pilT、fimV、pilK、pilRS、cpdA等13个基因或操纵子进行敲除,通过测定相关表型以及透射电子显微镜观察发现:编码菌毛的结构基因cpdA对羧苄青霉素变得敏感,但是蹭行运动能力未发生显著变化。其余菌毛相关基因突变后蹭行运动能力都显著降低,但是其对羧苄青霉素的敏感性未发生明显改变。此外,实验中也检测了菌株对其它16种抗菌药物的敏感性,结果显示只有cpdA突变体的敏感性发生变化。运用转座突变技术我们构建了覆盖基因组6倍左右的转座突变体文库,包含41000个单克隆。筛选获得21株蹭行运动和羧苄青霉素同时有显著变化的转座突变体,此外测定了其它16种抗菌药物的敏感性,结果显示:这些转座突变体对检测的抗菌药物表现出与羧苄青霉素一样的敏感程度,测序分析表明其基因没有已知的与Ⅳ菌毛相关的基因。同时构建其中的dsbA、wbpL、crC基因的敲除突变体,验证其表型与转座突变体一致。最后结合文献报道对这三个基因编码的蛋白通过软件进行蛋白互作的预测,其中DsbA、CrC被报道均与PilA有关。因此dsbA、wbpL、crC可能在全基因组上是全局调控子而且也是潜在的与Ⅳ菌毛有关的基因。通过研究表明菌毛合成相关基因突变后菌体的蹭行运动发生变化与其对羧苄青霉素的耐药性并不存在直接的关系,可能菌体的蹭行运动发生变化只是菌体对抗生素的抗性发生变化时表现出的其中的一种表型,具体的作用机制还有待进一步研究;此外研究也发现dsbA、wbpL、crC可能是潜在的与菌毛相关的基因,这就为Ⅳ菌毛的基因家族提供了新的成员,为更好的探究菌毛的作用机理提供新线索。

关键词：铜绿假单胞菌耐药性抗生素蹭行运动 Ⅳ菌毛羧苄青霉素

产酶溶杆菌中一种新AlgC类蛋白Le2152调控蹭行运动的机制初探

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产酶溶杆菌中一种新AlgC类蛋白Le2152调控蹭行运动的机制初探

作者：费世芳南京农业大学

学位级别：硕士

产酶溶杆菌OH11是本实验室从辣椒根际土壤中分离得到的一种十分有应用前景的农业生防细菌,具有广谱的抗真菌活性,不仅可以产生的多种胞外水解酶,还可以分泌抗真菌物质HSAF(Heat-Stable Antifungal Factor),从而抑制病原真菌菌丝生长来... 详细信息

产酶溶杆菌OH11是本实验室从辣椒根际土壤中分离得到的一种十分有应用前景的农业生防细菌,具有广谱的抗真菌活性,不仅可以产生的多种胞外水解酶,还可以分泌抗真菌物质HSAF(Heat-Stable Antifungal Factor),从而抑制病原真菌菌丝生长来防治多种植物病原卵菌和真菌引起的植物病害。Ⅳ型菌毛(Type Ⅳ pili,T4P)介导的蹭行运动是产酶溶杆菌重要的分类依据,并且与该菌的吸附、定殖等活动也息息相关,因此是产酶溶杆菌生防能力评价的重要因素。本文以产酶溶杆菌OH11为研究对象,对其蹭行运动的调控机制进行探索。实验室前期已经对T4P的组装系统进行了研究,并报道了 Clp和PilR等转录因子蹭行运动调控机制,为了探究出新的蹭行运动调控机制,我们对实验室的突变体库进行了筛选后,得到了一株蹭行运动完全丧失的菌株,鉴定为Le2152,Pfam分析发现 Le2152 含有 PGM-PMM(phosphoglucomutase-phosphomannomutase)结构域,在对OH11全基因组进行对比分析后发现还存在另外一个含有这种结构域的蛋白Le4861,但是Le4861基因敲除后蹭行运动并受到没有影响。为了进一步探索二者存在这种差异的原因,利用生物信息学软件TMHMM和SMART等对其结构域进行了分析预测,结果发现Le2152除了PGM-PMM结构域外,N端还存在着一个周质的dCache(DoubleCache)结构域,并且这种结构域不同于以往报道的几种dCache结构域。含有与相似Le2152结构域的蛋白存在于变形菌纲的至少8个目中,Le2152蛋白具有保守性和代表性。在1991年首次克隆铜绿假单胞菌AlgC蛋白酶可溶部分之后,人们对AlgC类型的蛋白研究中都是使用的N末端截短的ORF(Open Reading Frame,ORF),本研究证明了产酶溶杆菌中Le2152蛋白除了具有PGM-PMM结构域外,还有dCache结构域共同组成了一个完整ORF,铜绿假单胞菌AlgC蛋白也存在着与Le2152相同的被忽略的dCache结构域,Le2152类型的磷酸甘露糖变位酶可以代表一种新的类AlgC蛋白。为了进一步探究Le2152调控蹭行运动的机制,我们首先利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)技术对Le2152的互作蛋白进行筛选以及质谱鉴定,共筛选得到了 403个蛋白。初步分析后发现其中存在7个TP4系统中调控蹭行运动的蛋白,随后利用细菌双杂交技术对Le2152与这7个蛋白进行了一对一筛选,结果发现PilA、PilS能够与Le2152蛋白互作。接着对Le2152、PilA、PilS进行截短后再次进行细菌双杂交试验,发现Le2152与PilA、PilS的互作发生在膜上。由于PilA、PilS均为跨膜蛋白,为了证明这种互作的特异性,我们将Co-IP数据中所有的跨膜蛋白分析出来,共包括42个跨膜蛋白,然后挑选出其中的5个蛋白与Le2152进行双杂交试验,发现只有一个Le3673能够与Le2152互作,另外的4个并不与Le2152互作,因此并不是所有的跨膜蛋白都可以和Le2152互作,它与PilA、PilS的互作具有特异性。接着我们选取了PilA蛋白对Le2152可能的调控途径进行了探索,发现Le2152不是通过影响PilA蛋白的表达、外泌、定位等来调控PilA,因此其互作具体的调控途径还有待进一步探究。

关键词：产酶溶杆菌蹭行运动 PGM-PMM结构域 dCache结构域 Le2152

辣椒疫霉中抑制产酶溶杆菌蹭行运动的效应子的筛选与鉴定

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辣椒疫霉中抑制产酶溶杆菌蹭行运动的效应子的筛选与鉴定

作者：葛程程南京农业大学

学位级别：硕士

产酶溶杆菌OH1 1(Lysobacter enzymogenesOH11)是本课题组从辣椒根际土壤中分离鉴定的一株生防革兰氏阴性细菌。菌株OH11无鞭毛,在自然生境中依赖于细胞表面附着的Ⅳ型菌毛(Type Ⅳ pilus,T4P)进行蹭行运动(Twitchingmotility)。通过这... 详细信息

产酶溶杆菌OH1 1(Lysobacter enzymogenesOH11)是本课题组从辣椒根际土壤中分离鉴定的一株生防革兰氏阴性细菌。菌株OH11无鞭毛,在自然生境中依赖于细胞表面附着的Ⅳ型菌毛(Type Ⅳ pilus,T4P)进行蹭行运动(Twitchingmotility)。通过这种独特的运动方式,菌株OH11可以接近,并以细胞聚集状态(生物膜)的方式附着/定殖在丝状病原真菌和卵菌的菌丝上,进而利用各种胞外水解酶消解菌丝,从而抑制病原菌的生长。这些前期研究表明T4P介导的蹭行运动是菌株OH11在自然生境中捕食病原真菌和卵菌的一种重要生防因子。在这种捕食过程中,菌株OH11会与病原菌直接接触,那么病原菌是否有相应的防御机制,比如通过次生代谢产物或效应子来干扰菌株OH11的蹭行运动,降低其定殖能力,从而防止自身被OH11过度捕食/杀死,这值得深入探讨。效应子是植物病原真菌和卵菌在侵染寄主过程中分泌到寄主细胞间隙或内部的一种毒性因子,它们可以在不同层面抑制寄主植物的免疫反应,促进病原菌的侵染。除此经典的功能外,近期研究还发现这些效应子中的部分还可以改变寄主植物内生微生物组,揭示了病原真菌卵菌可以利用效应子与生境中相关微生物进行互作。本研究与南京农业大学植保学院窦道龙教授课题组合作,选择一种与OH11有同样生境,且危害严重的植物病原卵菌--辣椒疫霉(Phytophthora capsici)为对象,探索该菌是否利用其效应子来抑制菌株OH11的蹭行运动,进而对OH11的定殖与捕食行为进行防御。本文筛选的54个辣椒疫霉效应子主要为质外体效应子和胞内效应子两大类,质外体效应子中包含Elicitin家族效应子9个、NLP家族效应子8个;胞内效应子包含CRN家族效应子16个、RxLR家族效应子21个。基于效应子数量多,且OH11蹭行运动的检测过程较繁琐,为提高筛选效率,故本研究首先选择实验周期短、操作简便的模式菌Escherichiacoli K-12MG1655作为研究系统来筛选哪个(些)效应子能抑制该菌株的运动性。将54个效应子分别导入到MG1655中进行诱导表达,通过对运动性的定性与定量检测,发现辣椒疫霉的PcCRN173和PcAvh540两个效应子能显著抑制MG1655的运动性,其中PcCRN173是CRN家族效应子,而PcAvh540是RxLR家族效应子。在此基础上,将PcCRN173和PcAvh540分别克隆到广宿主载体中,并导入到OH11中开展蹭行运动检测。研究发现,与含有空载体对照的OH11菌株相比,导入PcAvh540后并未明显改变OH11的蹭行运动,而导入PcCRN173后则显著抑制OH11的这种运动能力。由于生物膜(一种细菌聚集状态)形成是菌株OH11成功定殖病原真菌和卵菌菌丝的关键,故本研究也探索了 PcCRN173对OH11生物膜形成的影响。与调控蹭行运动相一致,导入PcCRN173的OH11与野生型相比,生物膜形成能力显著降低,而导入PcAvh540的OH11生物膜形成能力并未下降。接下来,本研究探索了 PcCRN173是如何在OH11中参与抑制蹭行运动和生物膜形成的机制。由于PcCRN173没有任何预测的DNA结合结构域,故本研究推测该效应子可能与OH11体内的某个(些)能调控蹭行运动的蛋白进行物理互作,通过它们来抑制OH11的蹭行运动。根据实验室前期研究已发现全局调控因子Clp、反应调控蛋白PilR、蛋白质降解酶ClpP均能控制OH11的蹭行运动,故本研究首先检测了PcCRN173与它们的互作情况。利用酵母双杂作为快速筛选系统,本研究未发现PcCRN173与Clp、PilR、ClpP互作,表明PcCRN173有可能与OH11体内未鉴定的可以调控蹭行运动的蛋白进行互作。鉴于LysR和GntR家族的转录调控蛋白在病原细菌中对运动性具有重要调控作用,为此本研究结合课题组前期积累,在OH11基因组中选取了 3个LysR家族蛋白(Le1404、Le2114和Le3293)以及2个GntR蛋白(Le1155和Le1310)的编码基因进行敲除,构建相应的突变株,以明确它们是否可以调控OH11的蹭行运动。结果表明在OH11中分别敲除Le2114和Le1155均导致该野生型菌株丧失蹭行运动,而分别敲除其他3个基因均不改变OH11的蹭行运动。通过酵母双杂系统检测也未发现PcCRN173与Le2114和Le1155的相互作用。综上所述,在本研究所给定的筛选与检测条件下,发现辣椒疫霉的效应子PcCRN173能抑制OH11蹭行运动与生物膜的形成,据此推测这是辣椒疫霉应对OH11捕食的一种防御方式。遗憾的是,虽然本研究开展了一系列的筛选工作,但暂未鉴定出OH11体内与PcCRN173的互作蛋白,这有待后续深入研究。

关键词：辣椒疫霉效应子产酶溶杆菌蹭行运动 PcCRN173

一个感应调控因子控制生物膜形成功能和蹭行运动的研究

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山东轻工业学院学报（自然科学版） 2010年第4期24卷 4-7页

作者：梁泉峰祁庆生山东大学生命学院微生物技术国家重点实验室山东济南250100

分离自废水中的食酸菌属菌株Q1能够在液固界面形成成熟的生物膜。利用转座子插入得到突变株△twbS,该突变株在生物膜形成功能缺失。经过序列分析,转座子插入基因与Acidovorax avenae sub *** AAC00-1和Diaphorobacter ***的感应激酶调... 详细信息

分离自废水中的食酸菌属菌株Q1能够在液固界面形成成熟的生物膜。利用转座子插入得到突变株△twbS,该突变株在生物膜形成功能缺失。经过序列分析,转座子插入基因与Acidovorax avenae sub *** AAC00-1和Diaphorobacter ***的感应激酶调控因子TwbS分别有60%和61%氨基酸同源性。进一步的研究表明该twbS基因与细菌的蹭行运动和Type IV菌毛的装配有关,从而影响细菌的初步粘附功能,最终达到调控生物膜形成。突变株△twbS可以通过回复突变实验恢复上述功能。

关键词：感应调控因子生物膜蹭行运动菌毛

鱼腥草素钠抑制铜绿假单胞菌致病相关运动能力的研究

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中国中药杂志 2015年第8期40卷 1585-1588页

作者：吴大强黄卫锋段强军程惠娟汪长中安徽中医药大学中西医结合临床学院微生物学与免疫学教研室安徽合肥230036 安徽省中医药科学院中西医结合研究所安徽合肥230036

鱼腥草素钠(sodium houttuyfonate,SH)是一种有效抑制致病菌感染的传统中药鱼腥草的活性成分的衍生物,但其抑菌机制尚没有被阐明。本研究通过铜绿假单胞菌运动能力试验发现,SH可在有效抑制与细菌致病性相关的浮泳运动、蹭行运动和集群... 详细信息

鱼腥草素钠(sodium houttuyfonate,SH)是一种有效抑制致病菌感染的传统中药鱼腥草的活性成分的衍生物,但其抑菌机制尚没有被阐明。本研究通过铜绿假单胞菌运动能力试验发现,SH可在有效抑制与细菌致病性相关的浮泳运动、蹭行运动和集群运动能力。平板分析法实验结果表明24 h内SH对浮泳运动、蹭行运动和48 h内SH对集群运动的抑制趋势呈现显著的浓度依赖性特点;并且在1倍SH最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)(512 mg·L^(-1))条件下,细菌的运动能力和阳性对照阿奇霉素(1倍MIC 16 mg·L^(-1))样基本丧失。进一步,基因表达分析发现SH显著抑制铜绿假单胞菌的鞭毛和菌毛结构基因flgB和pilG的表达,提示SH抑制细菌运动能力的可能机制是通过抑制细菌运动相关的特殊结构鞭毛和菌毛的合成而产生。因此,该研究结果首次证明SH可有效抑制细菌的运动能力,并探讨了抑制机制,为该药物在临床上治疗条件性致病菌铜绿假单胞菌提供理论依据。

关键词：鱼腥草素钠铜绿假单胞菌浮泳运动蹭行运动集群运动

铜绿假单胞菌mexS基因对其运动能力的影响

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南开大学学报（自然科学版） 2015年第5期48卷 44-50页

作者：郭建慧何沿沿陈荣浩吴卫辉金守光靳永新南开大学生命科学学院天津300071 佛罗里达大学分子遗传学与微生物学系

使用同源重组方法构建mex S基因突变菌株PAO1mex S::Ω,检测其与铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1泳动,蹭行运动及蜂群运动能力.结果表明:与野生型菌株相比,PAO1mex S::Ω这3种运动能力均显著增加;构建mex S互补菌株PAO1mex S::ΩC,通过检测... 详细信息

使用同源重组方法构建mex S基因突变菌株PAO1mex S::Ω,检测其与铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1泳动,蹭行运动及蜂群运动能力.结果表明:与野生型菌株相比,PAO1mex S::Ω这3种运动能力均显著增加;构建mex S互补菌株PAO1mex S::ΩC,通过检测互补株的泳动、蹭行运动及蜂群运动能力,发现mex S基因回复了突变株这3种运动能力.为了探索mex S基因调控这3种运动能力的分子机制,进一步提取了PAO1与PAO1mex S::Ω菌株RNA,使用RNA测序技术比较两者全基因组转录水平,结果发现与野生型菌株相比,PAO1mex S::Ω中部分运动能力相关基因的表达水平发生了明显地变化.本文首次报道mex S基因影响铜绿假单胞菌的运动能力.

关键词：铜绿假单胞菌 mexS基因泳动蹭行运动蜂群运动

产酶溶杆菌中ChpA与PilZ蛋白的鉴定及其调控菌体运动性的机制研究

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产酶溶杆菌中ChpA与PilZ蛋白的鉴定及其调控菌体运动性的机制研究

作者：周密密南京农业大学

学位级别：硕士

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)是农业植物病害生物防治中一种重要的革兰氏阴性细菌,其由IV型菌毛(Type IV pili,T4P)介导的跳蹭行运动(twitching motility,TM)在抑制植物病原真菌的功能中具有重要作用。但是溶杆菌调控TM的功能机... 详细信息

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)是农业植物病害生物防治中一种重要的革兰氏阴性细菌,其由IV型菌毛(Type IV pili,T4P)介导的跳蹭行运动(twitching motility,TM)在抑制植物病原真菌的功能中具有重要作用。但是溶杆菌调控TM的功能机制还不清楚。本文以产酶溶杆菌OH11菌株作为模式菌,研究发现了两个TM调控因子,ChpA杂合的双组分蛋白和PilZ结构域蛋白,两者均正向调控菌体的TM。本研究发现杂合的双组分蛋白ChpA包含7个结构域,具有自身磷酸化、磷酸基团转移、磷酸受体的功能。实验表型显示出chpA缺失突变体菌落边缘的细胞不再向外滑动,证明了chp 的缺失突变体完全丧失了TM。进一步进行结构域缺失及表型检测,研究表明负责磷酸化和磷酸基团转移的结构域是ChpA调控TM必不可少的结构,而负责接受磷酸基团的结构域则是非必要的。此外本研究对chpA缺失突变体的转录组进行分析,发现ChpA参与调控243个基因的表达。这些基因表达的产物参与菌体的多种生理和生物进程,首次证明革兰氏阴性细菌中保守的ChpA广泛的影响着基因的表达。另一方面,研究发现很多细菌中PilZ结构域的蛋白参与调节多种生物功能如:运动性、致病性、表面粘附、生物膜。本文运用生物信息学、基因组学手段在产酶溶杆菌OH11基因组中发现一个PilZ结构域蛋白基因。氨基酸序列比对发现,PilZ不存在结合c-di-GMP所需的N端氨基酸结构RxxxR or DxSxxG,体外MST结合实验证实PilZ不能结合c-di-GMP。pilZ缺失突变后菌体的TM完全丧失。进一步利用细菌双杂交技术及体外蛋白-蛋白互作Pull down实验检测并确定PilZ能与T4P组装所必须的ATPase蛋白PilB发生相互作用。pilB缺失后产酶溶杆菌丧失TM,揭示了PilZ通过与PilB相互作用调节菌体的TM。最后我们预测两个蛋白的可能关键位点并进行点突变,结果发现PilZ的W71是其与PilB互作调控TM功能时的关键氨基酸位点而非Y24,而PilB的ATPase酶活中心关键氨基酸E333,K397则不是其与PilZ互作所必须的,但二者是PilB调控TM的关键位点,显示酶活中心不影响蛋白-蛋白互作。本文初步揭示了 ChpA调节TM时的磷酸化功能机制并证明其广泛调节多种基因的表达的功能,为进一步了解Pil-Chp信号系统在产酶溶杆菌中调控的生理生化功能机制提供理论基础。而PilZ与PilB相互作用并利用的关键结构位点调控菌体的运动机制,为后面进一步明确PilZ结合PilB调控途径引起的具体的生化机理奠定基础。

关键词：产酶溶杆菌 T4P 蹭行运动 ChpA PilZ PilB